前蛋白轉化酶枯草溶菌素9及其抑制劑的研究進展

陳麗 廉姜芳 周建慶

前蛋白轉化酶枯草溶菌素9及其抑制劑的研究進展

陳麗 廉姜芳 周建慶

前蛋白轉化酶（PCs）在維持人體的穩態中起著重要作用，同時參與一系列病理生理過程。前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（PCSK9）是PCs家族的重要成員之一，參與糖脂代謝,神經系統的凋亡和分化，并在腫瘤的發生、發展中起到一定的作用。同時，大量的基礎和臨床研究已證實，PCSK9抑制劑能明顯降低血LDL-C水平，從而減少心血管事件的發生。現就PCSK9的研究成果，尤其在多種疾病中的功能作一綜述，并闡述PCSK9抑制劑的臨床研究進展。

PCSK9 脂代謝 PCSK9抑制劑

前蛋白轉化酶（proproteinconvertases,PCs）是一類鈣離子依賴的絲氨酸內切酶，其基本功能是對前體蛋白的一個或多個內在位點進行水解從而將其激活[1-3]。2003年Seidah等[3]首先發現了一種新的PCs成分，其主要在肝臟合成，前體由692個氨基酸組成，在內質網裂變和自動催化后合成可溶性酵素酶，繼而通過細胞的分泌通道被釋放到血液中，命名為神經凋亡調節轉換酶1（NARC1），是PCs家族新成員。同年Abifadel等[4]觀察到2例NARC1基因功能獲得性變異患者血膽固醇明顯升高和早發心血管死亡，發現這是除低密度脂蛋白受體(LDLR)、ApoB外，第三個與常染色體顯性家族性高膽固醇血癥相關的基因，此研究結果發表在Nature Genetics上，此后NARC1正式更名為前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（PCSK9）。已有大量研究證實PCSK9對血脂調節的影響，其與家族性高膽固醇血癥、冠心病、代謝綜合征等疾病密切相關。但近幾年的研究發現，PCSK9在神經系統疾病和腫瘤等疾病中也起到重要的作用。由此可見，對PCSK9的研究日趨深入和廣泛，因而有必要對PCSK9的研究進展作一綜述。

1 PCSK9的結構、分布及其表達調節

PCs家族在哺乳動物中共有9個成員，它們是PC1/ 3、PC2、弗林蛋白酶（Furin）、PC4、PC5/6（含A和B兩個亞型）、PACE4和PC7以及兩個非堿性氨基酸特異性的轉化酶SK-1/S1P和NARC-1/PCSK9。NARC1/PCSK9是由PCSK9基因所編碼，由692個氨基酸構成，屬于枯草蛋白酶中蛋白酶K亞家族的成員，基因定位于1p34.1-p32，全長29kb，由12個外顯子構成，編碼區約為2kb，其氨基酸序列可分為信號肽（1-30）、前片段（31-147）、催化域（148-425）、p2域和富含半胱氨酸的碳末端（526-692）幾個結構域[5]。

PCSK9表達于肝細胞、神經細胞、腎間質細胞、小腸結腸上皮細胞和胚胎細胞等，其中對肝細胞和神經細胞的增值、分化起到重要作用[6]。Labonte等[7]發現PCSK9可下調丙型病毒性肝炎受體，LDLR以及跨膜蛋白CD81。PCSK9對腎間質細胞和腸細胞的調節缺乏相關報道。

2 PCSK9與脂質代謝、動脈粥樣硬化

已知冠心病與多種遺傳因素有關，尤其是參與脂代謝的多個基因在冠心病的發生、發展中起重要作用，而血管內皮下LDL-C的沉積是冠心病的主要病理基礎。近年研究發現，PCSK9對膽固醇代謝有重要調節作用，并可能直接或間接的參與冠心病的發生、發展[8]。Denis等[9]在高脂高膽固醇喂養的小鼠模型中發現，PCSK9基因失活顯著降低主動脈的膽固醇酯，PCSK9基因過表達促進動脈粥樣硬化的發展。目前較為認可的機制是PCSK9通過調節肝臟脂質代謝進而影響血脂從而間接參與動脈粥樣硬化。正常代謝過程是LDL-C通過肝細胞LDLR的內吞作用在溶酶體內降解，LDLR重新循環至肝細胞表面再發揮降低LDL的作用。而PCSK9通過結合于肝細胞LDLR的表皮生長因子（EGF）樣結構域，與LDL共同內化，抑制LDLR的釋放與返回細胞膜，誘導LDLR進入溶酶體內降解，導致細胞表面LDLR數量的減少，最終將導致血LDL-C的水平升高[10]。每個LDLR可再循環150次，因此PCSK9引起的LDLR的輕度下調可致LDL-C的巨大改變。

也有學者認為細胞內低膽固醇激活細胞內固醇調節元件結合蛋白2（SREBP-2），從而促進LDLR基因的表達，使循環中的LDL-C減少。但與此同時SREBP-2也促進PCSK9的表達，使LDLR下調，從而抑制肝膽固醇吸收并增加血循環中LDL-C[11-12]。然而Brown和Carious等[13-14]研究認為PCSK9對血管壁的直接作用在動脈粥樣硬化發生、發展中發揮重要影響，具體作用及機制仍不詳，有待于進一步研究。有趣的是，在動脈粥樣硬化發病機制中，PCSK9除調節脂質代謝外，還可能參與炎癥反應、內皮損傷、血流動力學改變、糖代謝等病理生理過程[15-20]。

已發現PCSK9基因突變分為兩種類型：功能缺失型和功能獲得型分別與低膽固醇血癥和高膽固醇血癥相關。功能獲得型突變可增強PCSK9上調LDL-C的能力，導致高膽固醇血癥，主要形式有S127R、D129G和E670G等[4,21]，功能缺失型突變可削弱或滅活PCSK9上調LDLC的能力，導致低膽固醇血癥，主要形式有R46L、G106R和C679X等,以攜帶Y142X和C679X的雜合子缺失型突變攜帶者為例，相比于非攜帶者，LDLC水平下降28%，冠心病的發生率下降88%[22]。以上發現提示，抑制PCSK9功能是一種降低LDL-C水平的有效策略。因此，PCSK9作為新的降脂靶點越來越受到關注。雖然臨床上他汀類藥物的應用極其廣泛，但它仍有一定的局限性。首先，他汀類藥物的不良反應有：肝臟、肌肉等損害；其次，他汀類藥物對于治療家族性高膽固醇血癥效果不理想。最重要的是，他汀類藥物的6%法則即單用他汀類藥物的降脂效果不夠理想，但即使加大他汀類藥物的使用劑量其降脂能力也只能增加6%左右[23]。Dubuc等[24]和Careskey等[25]研究顯示，他汀類藥物在升高LDLR的過程中可能反饋性的使PCSK9的表達增加從而產生了一定的拮抗作用,這也在一定程度上解釋了他汀類藥物的6%法則。

大量的基礎和臨床研究均已證實，PCSK9抑制劑能顯著降低血LDL-C水平，且耐受性和安全性良好。2007年，第一個PCSK9抑制劑誕生，之后多種不同途經的PCSK9抑制劑相繼出現，主要包括：（1）抑制PCSK9的合成：反義寡核苷酸（ASOs）、小分子干擾RNA（siRNA）；（2）抑制PCSK9與LDL-R的結合：單克隆抗體、小分子多肽。其中單克隆抗體類藥物發展最快，以PCSK9為靶標的單克隆抗體可以與PCSK9發生特異性結合，阻斷PCSK9與LDLR的相互作用，減慢LDLR的降解過程從而發揮降低LDL-C水平的作用。目前熱門研究的藥物為Amgen公司的Evolocumab（AMG-145）和Regeneron/Sanofi公司 Alirocumab（REGN-727/SAR-236553），已進入Ⅲ期臨床試驗[26]。

DESCARTES-2[27]研究隨訪52周納入901例接受大劑量他汀治療后LDL-C＞75mg/dl的非冠心病或冠心病患者，參與者隨機接受每4周1次的Evolocumab 420mg或安慰劑治療，參與者同時還分別接受單獨飲食調整、阿托伐他汀10mg及飲食調整、阿托伐他汀80mg或阿托伐他汀80mg+依折麥布10mg的基礎治療。到第52周，Evolocumab使低心血管風險和冠心病患者的LDL-C水平降低57%，超過安慰劑[27]。

GLAGOV研究納入197個中心的968例癥狀性冠狀動脈疾病患者，484例患者在他汀治療基礎上隨機接受Evolocumab（皮下注射420mg，每月1次）治療，484例患者應用安慰劑治療，治療時間為76周。最終846例患者完成隨訪。采用血管內超聲（IVUS）評估斑塊進展或消退情況。主要終點是治療78周后相對基線的斑塊體積百分比（PAV）變化，次要終點包括斑塊總體積（TAV）變化、斑塊逆轉的患者百分比。試驗結果顯示，治療78周后，安慰劑組達到的平均LDL-C水平為93.0mg/dl，相對于基線降低3.9%；Evolocumab組LDL-C水平則達到36.6mg/dl，較基線下降59.8%，差異十分顯著。Evolocumab組PAV減小0.95%，安慰劑組無明顯變化（P＜0.01）。Evolocumab組TAV縮小5.8mm3，安慰劑組縮小0.9mm3，兩組差異明顯（P＜0.01）。Evolocumab組64.3%的患者顯示出斑塊逆轉，安慰劑組的比例為47.3%。此外，研究尚未發現平均LDL-C達到36.6mg/dl水平時有安全性問題；新發糖尿病、肌痛或神經認知不良反應也未增加[28]。

Alirocumab成為第一個獲得FDA批準的PCSK9抑制劑。16項Ⅲ期臨床試驗來評估Alirocumab的安全性及有效性，部分試驗已被注冊或完成。ODYSSEY COMBOⅡ研究評估720例心血管事件高危且使用了最大耐受劑量他汀的患者使用Alirocumab的有效性和安全性。Alirocumab用法為：75mg注射，每2周1次，如果8周時LDL-C水平＞70mg/dl劑量增加至150mg注射，每2周1次。對照組接受最大耐受劑量他汀和依折麥布10mg/d，及安慰劑。結果顯示，Alirocumab組患者LDL-C水平較基線降低了50.6%，依折麥布組患者降低了20.7%（P＜0.01）。24和52周時，Alirocumab組LDL-C水平分別為51.6、53.3mg/dl[29]。

ODYSSEY FHⅠ和Ⅱ研究共有735例雜合子家族性高膽固醇血癥患者，接受了最大耐受劑量他汀但LDL-C水平未達到＜70mg/dl（有心血管疾病史）或者＜100mg/dl（無心血管疾病史），將這些患者隨機分配到Alirocumab組（75mg每2周1次）或安慰劑組；如果8周時LDL-C水平＞70mg/dl劑量增加至150mg注射，每2周1次。結果表明，患者LDL-C水平較基線降低了近49%，接近40%的雜合子家族性高膽固醇血癥患者接受了150mg劑量的Alirocumab。24和52周時，患者的平均LDL-C水平為70mg/dl[30]。

ODYSSEY Long-Term研究評估2 341例家族性高膽固醇血癥患者或者心血管事件高危患者使用Alirocumab的有效性和安全性，這些患者接受了最大耐受劑量他汀治療但LDL-C水平＞70mg/dl。患者被隨機分配到Alirocumab組（150mg，每2周1次）或安慰劑組。主要療效終點為24周時LDL-C水平的下降，次要終點為12和24周時LDL-C水平基線變化百分比及其他血脂水平。結果顯示，24周時Alirocumab組LDL-C水平下降61%，而安慰劑組升高0.8%。這結果與完整試驗結果一致，78周時LDL-C下降58%。同時，Alirocumab組相比于安慰劑組血清TG水平和脂蛋白a水平明顯下降，HDL-C水平升高。Alirocumab組的心血管不良事件發生率低于安慰劑組[31]。

ODYSSEY OUTCOMES研究納入18 000例急性冠脈綜合征患者，將會被隨機分配到最佳藥物治療組或最佳藥物治療組+Alirocumab組，隨訪時間長達2年，將在2017年底完成。若ODYSSEY OUTCOMES研究顯示心血管的獲益，Alirocumab的適應證將進一步擴大[29]。

短期研究顯示，單克隆抗體藥物降低LDL-C的幅度超過50%，這一降幅相當于大劑量的強效他汀類藥物治療，且安全性和耐受性良好。但目前已公布的研究周期較短、樣本量小、缺乏長期安全性和有效性的證據，因此有待于進一步的大量臨床研究驗證。有4項PCSK9抑制劑大規模臨床預后試驗正在進行中，包括ODYSSEY OUTCOME、FOURIER、SPIRE-1和SPIRE-2，共納入70 000研究對象，均為急性冠脈綜合征后LDL-C＞70mg/dl的高危心血管患者，觀察3～4年，大部分研究結果預計在2017年底前后公布。該研究結果的公布將進一步明確PCSK9抑制劑對心血管事件的影響，并為新一代降脂藥物的研發提供充足的理論依據[32-34]。

此外，最新研究表明，inclisiran（ALN-PCSsc）是一種長效的、RNA干擾（RNAi）方式抑制PCSK9合成進而降低人體的LDL-C水平的制劑。Ⅰ期試驗中，將LDL-L水平不低于100mg/dl的健康志愿者，按比例3∶1隨機分配至兩組。兩組參與者分別接受inclisiran或安慰劑皮下注射：劑量組分配至單次給藥劑量遞增階段（25、100、300、500或800mg）或多次給藥階段（每周1次125mg，給藥4次；隔周1次250 mg，給藥2次；或每月1次300或500mg，給藥2次，聯合或不聯合他汀類藥物治療）；每個劑量組包括4～8例參與者。結果顯示，最常見的不良事件為咳嗽、肌肉骨骼疼痛、鼻咽炎、頭痛、背痛和腹瀉。所有不良事件均為輕或中度。未觀察到嚴重不良事件發生。給藥劑量達到300mg或更高（單次或多次給藥）時，inclisiran可顯著降低PCSK9和LDL-L至少6個月。inclisiran研究是小型Ⅰ期試驗，其長期安全性及有效性有待于進一步研究[35]。

3 PCSK9/NARC-1與神經系統疾病

隨著研究的深入，發現PCSK9就是與膽固醇代謝相關并與神經細胞分化和凋亡相關的基因。PCSK9基因產物最初發現于神經細胞，損傷引起神經細胞凋亡時該蛋白表達增多。目前研究發現，PCSK9在胚胎發育中有促進神經細胞分化的作用，而體外細胞實驗證明PCSK9可促進神經細胞的凋亡。Bingham等[36]研究發現NARC-1mRNA在小腦顆粒神經元（CGNs）的表達發生在凋亡損傷后,而凋亡調節因子（caspase-3和死亡受體6）的共同調節增加了NARC-1參與神經元凋亡信號傳遞的可能性。用野生型和突變型NARC-1/EGFP融合載體轉染CGNs，然后計算在轉染子中細胞死亡的數量，發現野生型NARC-1有著強大的促凋亡效應。而NARC-1/EGFP過表達從而誘導細胞死亡的機制仍然不清楚[37]。

PCSK9不僅僅與神經細胞凋亡有關，還與神經細胞分化密切相關。Seidah等[6]取胚胎13.5d的端腦細胞培養，轉染PCSK9可增加未分化干細胞向神經細胞分化，認為PCSK9參與大腦皮層細胞分化。Poirier等[38]分別建立小鼠胚胎癌細胞系細胞P19和斑馬魚模型,研究蛋白水解酶對中樞神經系統 (CNS)分化的潛在作用。發現NARC-1/PCSK 9的mRNA水平在分化的第2天達到峰值,隨后出現下降,但是并沒有影響內源性LDLR的蛋白水平。進一步比較出生1天的小鼠中NARC-1/PCSK9和LDLRmRNA的表達,發現NARC-1/PCSK9除了在肝臟和小腸等組織表達還在小腦神經元有表達,而LDLR卻不顯著。因此提示NARC-1/PCSK9在神經系統中可能促進其它受體在小腦和端腦發育過程中某些蛋白的降解[11,38]。這些研究揭示了PCSK9除了在肝臟中的作用外在中樞神經系統分化中又有新的作用,而NARC-1/ PCSK9對不同物種如哺乳動物和魚類,神經系統的作用是不同的,具體機制還有待研究。神經系統退行性病變是危害老年人健康和影響老年人生活質量的一類疾病，如帕金森病和阿爾茲海默病。促進神經細胞分化，抑制其凋亡是防治神經系統退行性疾病的重要環節。如何利用PCSK9的這種雙面性作用以更好地防治神經系統退行性病變有待于進一步研究。

4 PCSK9與腫瘤

研究發現PCSK9過表達可引起細胞的凋亡、炎癥及應激反應等多條通路失調。腫瘤的發生、發展涉及到細胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物效應，因此推斷PCSK9在腫瘤的發生、發展中起到一定的作用[16,39-40]。Demidyuk等[41]利用qRT-PCR檢測PCs家族在30例病理分型尚不明確的肺癌組織及正常癌旁肺組織的mRNA，發現PCSK9在29例正常組織中均表達，而只在18例肺癌組織中表達。分析PCSK9在腫瘤和正常組織之間mRNA水平有統計學差異（P＜0.05）。由此可見，PCSK9在肺癌中呈低表達，而其在肺癌中的具體作用機制尚不明確。Lan等[39]證實PCSK9誘導膽固醇合成基因上調從而導致體內膽固醇減少，此外還發現PCSK9在肝癌Hep G2細胞內除影響膽固醇代謝還可作用其他基因表達通路，而這些通路與膽固醇的代謝是無關，包括蛋白質泛素化、異物質新陳代謝、細胞周期、炎癥及應激反應。這些細胞的基因表達通路與腫瘤的發生、發展有一定關系，可見PCSK9在多種腫瘤表達及與腫瘤發生、發展的多種細胞生物學過程有關。研究發現，PCSK9可影響核因子B（NF-κB）途徑、p53、轉錄因子3、腫瘤壞死因子超家族成員4基因相關通路[41]。NF-κB是一種轉錄因子，異常激活的NF-κB與細胞炎癥、惡性腫瘤生長、惡性轉化、腫瘤侵襲轉移有關[42]。TNF-α水平在胃癌明顯增高，其增高程度與臨床分期有關[43]，而PCSK9與p62、NF-ΚB及TNF-α均有聯系，這些通路與PCSK9蛋白在胃癌的病理分化程度及淋巴結轉移中有著密切關系。因此，PCSK9可能與胃癌發生及淋巴結轉移有關，但具體機制有待于進一步研究。因此，PCSK9可作為新的篩選指標及預后指標，并為靶向藥物的研究提供新的思路。

5 PCSK9與其他

PCSK9參與多種疾病的發生、發展。Burkart等[44]研究表明，PCSK9可通過增加膽固醇水平，進而促進慢性阻塞性肺炎的發生，因而PCSK9對慢性阻塞性肺炎具有潛在的診斷價值。此外，Persson等[45]研究發現，在大鼠中高水平的內源性雌激素可降低血漿PCSK9水平，表明內源性雌激素可增加肝細胞表面LDLR數量。這在一定程度上可以解釋絕經前后婦女的血脂改變[46]。不久的將來，PCSK9的更多功能將被揭曉。

6 小結與展望

綜上所述，已經明確PCSK9通過降解LDLR從而在膽固醇代謝中發揮重要作用。同時PCSK9抑制劑如單克隆抗體、RNA干擾的基礎和臨床研究均顯示出令人欣喜的進展，有望成為新的革命性降脂藥物，為高膽固醇血癥的聯合治療開辟新的途徑。PCSK9在帕金森病、肝癌、慢性阻塞性肺炎等疾病的發生、發展中能否起著重要作用，能否作為這些疾病早期診斷的分子標志，以及能否作為肝癌等腫瘤靶向治療的有效靶標，這些都是我們任重而道遠的研究任務。因而，深入研究PCSK9在神經系統疾病、腫瘤、呼吸系統疾病中的功能并分析其具體的分子機制，將為探索PCSK9調控人類疾病的研究奠定基礎，為臨床靶向治療疾病提供新的靶點。

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（本文編輯：沈昱平）

中國科協印發科技工作者自律規范：堅持四個“自覺”堅守四條“底線”

為弘揚科學精神，中國科學技術協會2017年7月13日印發《科技工作者道德行為自律規范》。近年來，我國科技發展取得舉世矚目的成就，也暴露出一些問題。2015年以來，我國科技界接連遭遇國外出版集團較大規模的集中撤稿，造成惡劣社會影響，國際聲譽受到直接沖擊。撤稿事件反映出我國少數科技工作者缺乏自律意識，底線意識不強，在名利誘惑面前心態失衡。

自律規范要求廣大科技工作者嚴于自律，堅持自覺擔當科技報國使命、自覺恪盡創新爭先職責、自覺履行造福人民義務、自覺遵守科學道德規范，堅守反對科研數據成果造假、反對抄襲剽竊科研成果、反對委托代寫代發論文、反對庸俗化學術評價等四條“底線”，肩負起推動創新驅動發展、建設世界科技強國的歷史重任。

自律規范明確反對委托代寫代發論文。要求科技工作者遵循論文撰寫和發表規范。反對以粗制濫造和低水平重復論文擠占浪費學術資源，共同抵制學術論文發表中第三方中介機構投機取巧謀取利益的不端行為，反對委托“第三方”代寫代投論文、對論文內容進行實質性修改、提供虛假同行評審人信息或評審意見，維護好中國科技工作者的社會形象和學術尊嚴，提升中國科學家的國際聲譽。

自律規范明確反對壓制學術民主和學術自由，反對濫用學術權力徇私舞弊利益尋租，反對學術評價中唯論文數量、唯S CI等不良傾向，反對行政化官本位等非學術因素影響評價，反對拉關系送人情，暗箱操作，褻瀆學術尊嚴。

中國科協要求各全國學會、地方科協和高校科協、企業科協組織科技工作者深入學習自律規范，加強自律監督；進一步改革完善科技評價體系，為科技工作者創新創業提供良好的政策和環境保障；積極指導推動高校、科研院所、醫院等建立學術道德委員會等內設機構，健全科研誠信制度規范，加大學術不端行為調查處理力度。

2017-02-06）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.16.2017-215

浙江省自然科學基金(L Y13H 020009)

315211 寧波大學醫學院（陳麗）；寧波大學醫學院附屬李惠利醫院心血管內科（廉姜芳、周建慶）

周建慶，E-mail：zh o u jian q in g8701@163.com