石墨烯量子點的生物學應用

吳慧俊

石墨烯量子點的生物學應用

吳慧俊

石墨烯量子點是石墨烯家族的衍生物，石墨烯量子點除了具有石墨烯的優良性能，還具有量子限制效應和邊界效應所產生的一系列新的特性，因此吸引了各領域科學家的廣泛關注。 石墨烯量子點這類新穎材料的研究在這兩三年內，無論是實驗還是理論方面均取得了極大進展。 石墨烯量子點生物相容性好，能夠光致發光，具有光電特性，可用于生物成像和生物傳感器。 作者著重探索石墨烯多樣的生物學應用，并從石墨烯量子點的發展、特性、制備方法、修飾、生物學應用、生物安全性等方面進行綜述。

石墨烯量子點；生物學應用；量子尺寸效應；制備方法；生物安全性

石墨烯及其衍生物氧化石墨烯受到了全世界科學家越來越多的關注。石墨烯具有杰出的光電特性，生物相容性也非常優秀。 然而石墨烯是一種零能隙的半導體，它在成像及光電學方面的應用一直受到很大的限制。 為了使石墨烯獲得能隙，一種零維的 衍 生 物——石 墨 烯量 子 點 (graphene quantum dots，GQDs) 應 運 而 生[1]。 GQDs 在 生 物、 醫 學、 材料、新型半導體器件等領域具有重要潛在應用。 作者從 GQDs的特性、制備方法、生物學應用、生物學安全性等方面進行綜述。

1 GQDs的光學特性

1.1 生物相容性好 尤其是經過各種化學修飾之后的 GQDs，可以進行特異性連接，細胞毒性低，對生物體危害小，可進行生物活體標志和檢測。 GQDs對原核細胞、真核細胞及人細胞無不良影響[2]。

1.2 熒光穩定 GQDs 比有機熒光分子要穩定，可以經受反復多次激發，而不像有機熒光分子那樣容易發生熒光漂白。 GQDs可以持續很長時間而不褪色，其熒光壽命可達有機染料分子的 100 倍以上，耐光漂白的穩定性也很強，可以對所標志的物體進行長時間的觀察。

1.3 發射波長可控 GQDs 的發射波長可通過控制它的大小和組成的材料來調節，因而可獲得多種可分辨的顏色。 不同大小的 GQDs能被單一波長的光激發而發出不同顏色的熒光，從而實現同時檢測。

1.4 斯托克斯位移大 GQDs 具有較大的斯托克斯位移和狹窄對稱的熒光譜峰，這樣就允許同時使用不同光譜特征的量子點，而發射光譜不出現交疊，或者只有很少交疊，使標志生物分子熒光譜的區分、識別變得很容易。

1.5 激發波長范圍寬 GQDs 的激發波長范圍很寬，發射波長范圍很窄，即可以使用小于其發射波長10 nm 的任意波長的激發光進行激發。 不同大小的GQDs可以由同一波長的光激發。

1.6 部分有上轉換發光 除了有強烈的下轉換的發光特性，一些 GQDs也展現了強烈的上轉換發光特性。

2 GQDs的制備方法以及表征

GQDs的合成方法主要有自上而下和自下而上2種方法。自上而下的方法是指通過物理或化學方法將大尺寸的石墨烯薄片切割成小尺寸的 GQDs，包括水熱法、電化學法和化學剝離碳纖維法等[3]；自下而上的方法則是指以小分子作前體通過一系列化學反應制備 GQDs。

2.1 自上而下的方法 指通過物理或化學方法將大尺寸的碳材料，比如碳納米管、石墨烯切割成小尺寸的 GQDs。

2.1.1 水熱法 水熱法是制備 GQDs 中使用比較普遍且產率較高的一種方法。 Pan 等[4]以高溫熱處理后的氧化石墨烯片作前體，制得尺寸更小(1.5 ～5.0 nm)、結晶度更好、發綠色熒光的 GQDs。 所制備的 GQDs 熒光性質均表現出 pH 依賴性。 Xu 等[5]對優化的水熱法合成了水溶性的帶有鋅的碳點，首先將 25 mL 0.1 mol/L 檸檬酸鈉和 0.05 mol/L 氯化鋅混合并倒入 50 mL 不銹鋼高壓釜，高壓滅菌釜保持在 185 ℃ 、4 h，待冷卻后用 0.22 μm 的圓柱形濾膜過濾器過濾即得帶有鋅的碳點。

2.1.2 物理化學法 把物理(輻射、微波等)和化學方法結合起來，把大尺度的碳材料打碎成 GQDs。Yao 等[6]認為微波熱解法是制備量子點最經濟綠色的方法，能快速同時制備大小均一的量子點。

2.2 自下而上的方法 與自上而下的方法相比，自下而上的方法相對較少，主要通過小分子碳的前驅物制備 GQDs，包括葡萄糖、檸檬酸等。

Tang 等[7]第 1 次報道了一種靈巧的、以葡萄糖為唯一原料的、輔以微波水熱法制備 GQDs的方法。一開始葡萄糖分子脫水形成 GQDs的核心碳碳雙鍵，提高加熱溫度，葡萄糖分子到達 GQDs 表面并且脫水形成新的碳碳雙鍵，新形成的碳碳雙鍵被有序地排列。

2.3 GQDs 的表征 以 Wang 等[8]合成的咖啡 GQDs為代表。

3 GQDs的修飾

GQDs性質穩定，有良好的發光性質，很多運用于生物醫學中的診斷治療。 所以，生物學上為了能加強 GQDs的功能，通常會對 GQDs進行化學上和物理上的修飾。

Lv 等[9]通 過 殼 聚 糖 (chitosan， CS)， 表 面 帶 正電，GQDs表面帶負電，依靠 H 鍵和靜電相互作用，由 CS 包裹 GQDs。 水楊酸鈉(sodium salicylate，SS)藥物載入，凍干形成 GQDs-CS-SS，加強藥物治療作用，并能通過 GQDs 診斷病灶部位；CS 因質子化團聚在石墨烯的表面，產生獨特的 3D 結構，加強了藥物的釋放作用和在體內成像的效果。

Yao 等[6]通過 pH 改變、透析碳化二亞胺[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)] 和 N-羥基琥珀酰亞胺(N hydroxysuccinimide，NHS) 反應等方法組成釓碳量子點(Gd carbon dots，Gd-CDs)/去 鐵 鐵 蛋 白 包 載 阿 霉 素 修 飾 葉 酸[apoferritin(doxorubicin)folic acid，Afn(DOX)/FA]組合物。 由于 Afn 在 pH 為 2.0 時可以分解為小單位，在 pH 為 7.4 時能夠通過非共價鍵反應重組為籠形蛋白，利用 pH 變化將 DOX 藥物包裹進入 Afn中，形成 Afn(DOX)。 然后通過微波熱解法將聚乙烯亞胺和檸檬酸反應形成 Gd-CDs，其中檸檬酸提供碳原子，聚乙烯亞胺負責修飾量子點表面。 在 EDCNHS 反應環境中產生共價鍵反應，連接 Afn(DOX)和 Gd-CDs。 葉酸可以靶向腫瘤，通過氮氣攪拌，把葉酸連接在組合物表面。

Gd-CDs/Afn(DOX)/FA 組合物加強了 DOX 藥物到達癌癥病灶部位的精確性，Gd-CDs 使藥物具有良好的光學性質，并且能磁共振成像，材料具有良好的水溶性和載藥量。

Zhu 等[10]把鐵量子點和 DOX 藥物包裹進入腫瘤細胞的細胞膜，新合成的材料具有體外同型腫瘤自識別和體內腫瘤自靶向功能，同時具有磁共振成像能力，提高了材料對于腫瘤治療和診斷的精確性。這種對量子點修飾包裹的方法旨在通過變換細胞膜，達到特性靶向作用。 同時鐵量子點作為核心能使用磁共振成像。

4 GQDs的生物學應用

由于 GQDs具有優良的光電特性、良好的生物相容性，所以在生物學上應用非常有價值。 在生物成像、生物傳感器等領域有許多有意義的應用。

4.1 在生物成像中的應用 量子點作為生物熒光探針已被廣泛應用于多種生物分析中，如細胞與組織成像及活體的研究。傳統的量子點一般由一些重金屬元素組成，在細胞內通過生物降解或光降解釋放出重金屬離子，從而產生細胞毒性[11]。 GQDs 的一系列特性，例如穩定光致發光、低生物毒性、良好溶解性和生物相容性等，使其成為極好的生物成像探針。

4.1.1 在 細胞成 像分析 中 的應 用 Zhu 等[12]取400 μg 光致發光 GQDs，加入 150 μL 培養基中與成骨肉瘤 MG-63 細胞一起培養，并沒有對成骨肉瘤MG-63 細胞的存活率產生任何影響。 通過激光共聚焦顯微鏡觀察，可發現量子點進入 MG-63 細胞并發出綠光，表明量子點能通過細胞膜進入細胞內部，GQDs在通過細胞后熒光效應不發生變化。 說明GQDs可被細胞攝取，并且發出熒光，該特性能用作細胞成像。

4.1.2 在組織成像分析中的應用 Qian 等[13]將雙光子氧 化 石 墨 烯 經 聚 乙 二 醇 (polyethylene glycol，PEG)修飾后打入小鼠耳血管中進行成像，在不同的激發光下，雙光子氧化石墨烯在血管中發出不同波長的熒光，較為穩定；在 6 h 之后，熒光消失一部分；15 h 后，無法看到熒光。

4.2 在生物傳感器中的應用 GQDs 最大的優點和特性即能發出熒光。 由于其熒光穩點、激發波長范圍寬、發射波長可控和斯托克斯位移大等特性，可以在不同激發光的作用下發出不同的光。由于這種光學特性，GQDs常用在電子通信業上。 生物學應用中將 GQDs的發光特性和信號通路的變化相偶聯，例如 GQDs在電化學傳感器技術方面的應用。

金屬離子和 GQDs之間的相互接觸會產生神奇的效果，接觸之后會明顯淬滅電化學發光。 由此特性，Li等[14]突發奇想，設計實驗將 GQDs 和金屬離子耦合，產生電化學敏感器；發現 GQDs可以被含氧集團修飾，選用了能夠和金屬離子絡合的氮對GQDs進行修飾，通過氮將 GQDs和 Cd 金屬離子結合，產生鎘石墨烯量子點復合物，淬滅電化學發光，成為有效的電化學敏感劑；在探索中，還發現了關于電化學敏感劑的協調物質。其一是乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA) ，由于 EDTA對于金屬的天然絡合屬性，EDTA 可以搶奪和 GQDs結合的金屬離子，使 GQDs和金屬離子分離，恢復電化學發光。 其二是半胱氨酸，可以作為掩蔽劑測定Cd，同時恢復電化學發光。 在進一步的探索下，在半胱氨酸一定量時，Cd 量越少，GQDs的發光強度越弱，Cd 和 GQDs 的發光強度呈線性關系，推斷可通過鎘石墨烯量子點的電化學發光敏感體系的發光強弱來測定 Cd 的濃度，即為 Cd 離子濃度傳感器。

4.3 在藥物輸送中的應用 GQDs 可以通過化學或者物理方法連接藥物，并通過化學修飾加強藥物的釋放效果和治療效果，GQDs和藥物的相結合將集診斷與治療于一體，為診療納米醫學技術提供更多的可能性。如何將脂溶性的藥物更準確輸送到病灶部位是制藥界的一大熱點。通常運載脂溶性藥物的載體為膠囊。 Jing 等[15]通過化學方法制備出診療智能 的膠 囊， 他 們將 二氧 化鈦 (titanium dioxide，TiO2)殼、橄欖油和 GQDs 等多種物質組合起來，制備成結構獨特的膠囊。 TiO2殼作為外殼，抑制紫杉醇的初期釋放，控制紫杉醇在恰當的時刻釋放，加強藥效；橄欖油作為藥物存儲地；GQDs 用于熒光成像，具有診斷功能。 表明這類診斷智能的膠囊可以有效運載脂溶性藥物，加強其釋放和藥效。

Wang 等[16]制備經 PEG 修飾的 GQDs，通過 PEG修飾后，量子點在 400 nm 的激發光下激發率增高，大約為 18.8%。 PEG 也為載藥提供 H 鍵，使經 PEG 修飾的 GQDs 有高載藥量為 2.5 mg/mg。 量子點通過PEG 修飾后性質也更為穩定。

4.4 在抗菌中的應用 GQDs 具有過氧化物酶的活性。 Sun 等[17]將 GQDs 結合低濃度過氧化氫，產生羥基自由基，既能殺死細胞，又不會損傷正常細胞，具有抗菌的藥理活性，該系統具有廣譜性。 通過這一性質，可以自制創可貼，用于傷口治療。

4.5 作為光敏劑的應用 不僅具有下轉換特性，還具有上轉換特性。上轉換特性可能是因為反斯托克斯過度，低能電子被激發成高能，在能量變化時，釋放出的上轉換光。 Zhuo 等[18]探索不同 TiO2和 GQDs的相互作用對亞甲基藍的光降解效果。亞甲基藍是光催化降解作用的測定指示劑。 若在可見光下，亞甲基藍的光降解效率越高，則說明該材料的光催化性越強。 Zhuo 等[18]將金紅石 TiO2/GQDs 和銳鈦礦TiO2/GQDs 復合材料作為光催化劑，在可見光下降解亞甲基藍。 表明 TiO2結構越簡單，光催化性能越優，組合的光催化性能和 GQDs有很緊密的關聯。

5 GQDs的生物安全性

GQDs是石墨烯衍生而得，因此 GQDs主要是由碳組成的納米材料，本身就有很低的毒性。 科研人員一直在探索 GQDs的生物毒性，無論是從細胞、組織還是動物體，GQDs均保持著很低的生物毒性，為GQDs投入生物學應用的安全性提供了很充足的理論依據。

5.1 對于生物體生殖毒性的研究 GQDs 對于生物體生殖毒性的研究受到越來越多研究者的重視，如果 GQDs對生物的生殖能力造成影響，那么它的生物應用也會受到影響，無法說明 GQDs的生物安全性。 Liang 等[19]探究了石墨烯對小鼠生殖能力的損傷影響，結果發現 GQDs對小鼠的生殖能力并無很大改變，生殖能力沒有變化。 說明 GQDs有很好的生物安全性。

5.2 對于生物體整體毒性的研究 GQDs 對生物體的毒性普遍較低。 Chong 等[20]將 GQDs 經尾靜脈注射到小鼠體內，注射石墨烯為對照組。 蘇木精-伊紅染色發現，石墨烯組出現石墨烯的殘留，組織切片示細胞凋亡且受損嚴重；GQDs組的組織切片細胞狀態較為完好。 說明 GQDs對生物體組織和整體的生物毒性很低，有很好的生物安全性。

6 展望

石墨烯量子因量子限制效應和邊界效應而展現出一系列新的特性，吸引了化學、物理、材料和生物等各領域科學家的廣泛關注。 近兩三年內，關于這種新型零維材料的研究，在實驗和理論方面均取得了極大進展。

隨著對 GQDs研究的一步步深入，GQDs在生物領域的應用越來越廣泛，逐漸成為納米醫學中的新秀。 我們應該不斷改善 GQDs的制備，優化工藝，突出其優異特點，更好地運用到生物學和醫學中，為人類健康作出貢獻。

[1]Eda G， Lin YY， Mattevi C， et al.Blue photoluminescence from chemically derived graphene oxide[J].Adv Mater，2010，22(4):505-509.

[2] 謝文菁，傅英懿，馬紅，等.熒光石墨烯量子點制備及其在細胞成像中的應用[J].化學學報，2012，70(20): 2169-2172.

[3] 王嬌嬌，馮苗，詹紅兵.石墨烯量子點的制備[J].化學進展，2013，25(1):86-94.

[4]Pan D，Zhang J，Li Z，et al.Hydrothermal route for cutting graphene sheets into blue-luminescent graphene quantum dots[J].Adv Mater，2010，22(6):734-738.

[5]Xu Q，Liu Y，Su R，et al.Highly fluorescent Zn-doped carbon dots as Fenton reaction-based bio-sensors:an integrative experimental-theoretical consideration[J].Nanoscale，2016，8(41):17919-17927.

[6]Yao H，Su L，Zeng M，et al.Construction of magnetic-carbon-quantum-dots-probe-labeled apoferritin nanocages for bioimaging and targeted therapy[J].Int J Nanomedicine，2016，11:4423-4438.

[7]Tang L，Ji R，Cao X， et al.Deep ultraviolet photoluminescence of water-soluble self-passivated graphene quantum dots[J].ACS Nano，2012，6(6):5102-5110.

[8]Wang L，Li W，Wu B，et al.Facile synthesis of fluorescent graphe quantum dots from coffee grounds for bioimaging and sensing[J].Chem Eng J，2016，300:75-82.

[9]Lv O，Tao Y，Qin Y，et al.Highly fluorescent and morphology-controllable graphene quantum dots-chitosan hybrid xerogels for in vivo imaging and pH-sensitive drug carrier [J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2016，67:478-485.

[10]Zhu JY， Zheng DW， Zhang MK， et al.Preferential cancer cell self-recognition and tumor self-targeting by coating nanoparticles with homotypic cancer cell membranes[J]. Nano Lett，2016，16(9):5895-5901.

[11]Lovric′J，Bazzi HS，Cuie Y，et al.Differences in subcellular distribution and toxicity of green and red emitting CdTe quantum dots[J].J Mol Med(Berl) ，2005，83(5):377-385.

[12]Zhu S，Zhang J，Qiao C，et al.Strongly green-photoluminescent graphene quantum dots for bioimaging applications [J].Chem Commun(Camb) ，2011，47(24):6858-5860.

[13]Qian J，Wang D，Cai FH，et al.Observation of multiphotoninduced fluorescence from graphene oxide nanoparticles and applications in in vivo functional bioimaging[J].Angew Chem Int Ed Engl，2012，51(42):10570-10575.

[14]Li LL，Ji J，Fei R，et al.A facile microwave avenue to electrochemiluminescent two-color graphene quantum dots[J]. Adv Funct Mater，2012，22(14):2971-2979.

[15]Jing Y， Zhu Y， Yang X， et al.Ultrasound-triggered smart drug release from multifunctional core-shell capsules onestep fabricated by coaxial electrospray method[J].Langmuir，2011，27(3):1175-1180.

[16]Wang Z，Xia J，Zhou C，et al.Synthesis of strongly greenphotoluminescent graphene quantum dots for drug carrier [J].Colloids Surf B Biointerfaces，2013，112:192-196.

[17]Sun H，Gao N，Dong K，et al.Graphene quantum dots-bandaids used for wound disinfection[J].ACS Nano， 2014， 8 (6):6202-6210.

[18]Zhuo S，Shao M，Lee ST.Upconversion and downconversion fluorescent graphene quantum dots:ultrasonic preparation and photocatalysis[J].ACS Nano，2012，6(2):1059-1064.

[19]Liang S， Xu S， Zhang D， et al.Reproductive toxicity of nanoscale graphene oxide in male mice[J].Nanotoxicology，2015，9(1):92-105.

[20]Chong Y，Ma Y，Shen H，et al.The in vitro and in vivo toxicity of graphene quantum dots[J].Biomaterials， 2014，35 (19):5041-5048.

The biological applications of graphene quantum dots

WU Huijun
(School of Life Sciences and Technology，Tongji University， Shanghai 200092， China)

The graphene and its derivative graphene oxide have attracted remarkable attention of scientists due to their extraordinary optical and electronic properties and biocompatibility.Recently， the study of graphene quantum dots(GQDs)has made great progress in theory and practice. Because of strong quantum confinement， excellent edge effects and biocompatibility， GQDs are helpful for bioimaging and biosensors.In this review， the various biological application of GQDs is introduced deeply in this article.The article mainly describes in sequence of development， character，synthesis， biological application and biological toxicity of GQDs.

Graphene quantum dots(GQDs) ； Biological application； Quantum confinement； Synthesis； Biological toxicity

O59

A

2095-3097(2017)01-0047-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.013

2016-11-06 本文編輯:徐海琴)

200092 上海，同濟大學生命科學與技術學院(吳慧俊)