肌細胞增強因子2D通過負向調控有絲分裂誘導基因 6 的表達促進肝癌細胞 PLC/PRF5和 SMMC7721 的增殖和遷移

陳 瀟，林志娟，李孟鵬，陳 超，王建勛，劉 佳，李培峰

·分子標志物·

肌細胞增強因子2D通過負向調控有絲分裂誘導基因 6 的表達促進肝癌細胞 PLC/PRF5和 SMMC7721 的增殖和遷移

陳 瀟，林志娟，李孟鵬，陳 超，王建勛，劉 佳，李培峰

目的觀察肌細胞增強因子 2D(myocyte enhancer factor 2D，MEF2D) 對肝癌細胞 PLC/PRF5 和SMMC7721 增殖和遷移的影響，并探究其是否通過負調控有絲分裂誘導基因 6(mitogen-induced gene 6，MIG6)的表達發揮作用。方法采用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術分別檢測肝癌細胞中 MEF2D 和 MIG6 轉錄水平的表達，以 MEF2D mRNA 表達量作為橫坐標，以 MIG6 mRNA 表達量作為縱坐標，制作線性相關圖；用小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA) 在 PLC/PRF5 細胞中下調 MEF2D 和 MIG6 后，通過細胞增殖與毒性測定試劑盒(7Sea-Cell Counting Kit，7Sea-CCK) 和細胞劃痕法檢測肝癌細胞增殖和遷移能力；用 siRNA 在 PCL/ PRF5 細胞中下調 MEF2D、用 MEF2D 過表達質粒在 SMMC7721 細胞系中上調 MEF2D 后，通過蛋白印跡檢測法分別檢測 MEF2D 和 MIG6 的蛋白質表達水平。 根據實驗，共分為陰性對照(negative control，NC)組、siMIG6 組、siMEF2D 組、si2M(同時下調 MIG6 和 MEF2D)組、空白對照組、空載對照組、MEF2D 組 7 組。結果肝癌細胞hcclm3、SMMC7721、PLC/PRF5、HepG2、7703、Huh7、Bel-7402 中 MEF2D mRNA、MIG6 mRNA 表達水 平 呈現負相關關系(r=-0.78) 。 細胞增殖實驗，24 h 和 48 h 時，下調 MIG6 或 MEF2D 后，與 NC 組比較，siMIG6 組或siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細胞增殖能力無顯著變化；同時下調 MIG6 和 MEF2D 后，與 siMEF2D 組比較，si2M組中 PLC/PRF5 細胞增殖能力無顯著變化。 72 h 時，各組間方差分析差異有統 計學意義 (F=20.68、 P ＜0.01) ；下調 MIG6 后，與 NC 組比較，siMIG6 組中 PLC/PRF5 細胞增殖能力顯著增強[ 光密度(optical density，OD)值為 3.73±0.18，t=3.84、P=0.02]；下調 MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細胞增殖能力顯著下降(OD=1.79±0.22，t=3.95、P=0.02)；同時下調 MIG6 和 MEF2D 后，與 siMEF2D 組比較，si2M 組中PLC/PRF5 細胞增殖能力增強(OD=2.99±0.03，t=4.83、P＜0.01)。 細胞劃痕實驗，各組間方差分析差異有統計學意義(F=42.27、P＜0.01) ；48 h 時，下調 MIG6 后，與 NC 組比較，siMIG6 組中 PLC/PRF5 細胞遷移能力顯著增強[細胞遷移率為(51 ± 4)%，t=3.22、P＜ 0.05)]；下調 MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中 PLC/ PRF5 細胞遷移能力顯著下降[細胞遷移率為(19±3)%，t=7.70、P＜0.01]；同時下調 MIG6 和 MEF2D 后，與siMEF2D 組比較，si2M 組中 PLC/PRF5 細胞遷移能力增強[細胞遷移率為(46±3)%，t=6.99、P＜0.01]。 蛋白質印跡檢測，下調 MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細胞 MIG6 蛋白表達水平顯著上升(t= 7.86、P＜0.001)；上調 MEF2D 后，與空載對照組比較，MEF2D 組中 SMMC7721 細胞 MIG6 蛋白表達水平顯著下降(t=4.61、P=0.004)。 結論 肝癌細胞 PLC/PRF5 和 SMMC7721 中 MEF2D 和 MIG6 表達量呈負相關關系，MEF2D 很可能通過負向調控 MIG6 的表達從而促進肝癌細胞 PLC/PRF5 和 SMMC7721 增殖和遷移。

肌細胞增強因子 2D；有絲分裂誘導基因 6；肝細胞癌；負向調控；細胞增殖；細胞遷移

肝 細 胞 癌 (hepatocellular carcinoma，HCC) 是 我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。目前HCC 的病因和發病機制仍未確定，因此努力尋找HCC 治療的特殊靶點，進而為腫瘤靶向治療提供新思路尤 為 重 要。 肌 細 胞 增 強 因 子 2D(myocyte enhancer factor 2D，MEF2D) 最初被認為是肌細胞特異性 DNA 結合蛋白。 以往研究表明，MEF2D 在肝癌中表現為上調，而且臨床肝癌樣本中 MEF2D 增高與不良預后相關聯[1]。 有絲分裂誘導基因 6(mitogen-induced gene 6，MIG6) 是一個抑 癌 基因， 它的缺失可以加快腫瘤進 程[2]。 本課 題組 前期 將肝 癌細胞中 MEF2D 下調后進行基因測序并通過 SAS 軟件分析基因芯片結果，發現 MEF2D 可能參與了對 MIG6轉錄的負向調控，在肝癌中發揮重要的作用。 本研究檢測 MEF2D 和 MIG6 在肝癌細胞 PLC/PRF5 和SMMC7721 中的表達情況，觀察下調 MEF2D 和 MIG6后，PLC/PRF5 和 SMMC7721 細胞增殖和遷移能力變化，并探討 MEF2D 對 MIG6 的負向調控作用機制，為肝癌的靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株 7702、PLC/PRF5、SMMC7721、hcclm3、Huh7、 HepG2、 7703、 Bel-7402、 Hela 購 自 中國科學院細胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和無 血 清 最 小 必 須 培 養 基 (Opti-Minimal Essential Medium，Opti-MEM)為美國 Gibco 公司產品；洛斯維-帕克紀 念 研 究 所 (Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640 培養基為美國 HyClone 產品；達爾伯克改良伊格爾培養基 (Dulbecco’s mo-dified Eagle medium，DMEM) 為美國 HyClone 產品；MEF2D 和 MIG6的小干 擾 RNA(small interfering RNA， siRNA) 購 自中國上海吉瑪制藥技術有限公司；空載對照質粒和MEF2D 質粒購自中國上海吉凱基因化學技術有限公司；互補 DNA(complementary DNA，cDNA) 反轉錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)RR047A、實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR) 試劑 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自中國大連 TaKaRa 公司；質粒大抽試劑盒 Endo-Free Plasmid Maxi Kit購自美國 Omega 公司；LipofectamineTM2000 轉染試劑購自美國 Invitrogen 公司； XfectTM納米顆粒轉染試劑購自中國大連 TaKaRa 公司；細胞增殖與毒性檢測試劑盒(7Sea-Cell Counting Kit，7Sea-CCK)購自中國七海生物公司；細胞裂解液購自中國索萊寶公司； 二辛可寧酸 (bicinchoninic acid， BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自中國索萊寶公司；脫脂奶粉購自中國伊利公司；MEF2D 抗體購自美國 BD Biosciences公司；MIG6 抗體購自美國 Cell Signaling Technology公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH) 抗 體 購 自 中 國博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標志山羊抗兔 IgG 和山羊抗小鼠 IgG 購自北京中杉金橋生物技術公司；ImmobilonTMWestern 發光檢測試劑購自美國 Millipore 公司。 其余試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 根據實驗，共分為陰性對照(negative control， NC) 組、 siMIG6 組、 siMEF2D 組、si2M(同時下調 MIG6 和 MEF2D) 組、空白對照組、空載對照組、MEF2D 組 7 組。

1.2.2 細胞培養 PLC/PRF5、SMMC7721 細胞使用 RPMI1640 培 養 基， 7702、 hcclm3、 Huh7、 HepG2、7703、Bel-7402、Hela 細胞使用 DMEM，細胞培養液均含 10%FBS，按 100 ∶1的比例加入雙抗，37 ℃、5% CO2條件下培養，每 2 d 換 1 次液，并用 0.25%的胰蛋白酶溶液進行傳代。

1.2.3 細胞轉染

1.2.3.1 siRNA 轉染 將 PLC/PRF5 細胞接種于 6孔板于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞匯合率達 70% ～ 80% 時，更換為 Opti-MEM 后進行轉染；用100 μL Opti-MEM 柔 和 混 勻 5 μL siRNA 和 LipofectamineTM2000 轉染試劑，室溫放置 5 min 后混勻兩者，室溫放置 20 min 形成復合物；將 200 μL 復合物加入 6 孔板中，補足 Opti-MEM 至 2 mL，37 ℃ 、5% CO2條件下培養 48 h 后提取蛋白質。

1.2.3.2 質粒轉染 將 SMMC7721 細胞接種于 6孔板于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞匯合率達 70% ～80%時，更換新鮮含 10%FBS 的 RPMI1640培養液進行轉染；用 100 μL Xfect反應緩沖液混勻 5 μL 質粒和 0.3 μL XfectTM納米顆粒轉染試劑，混合兩者后渦旋數秒，室溫放置 15 min 形成復合物；將200 μL 復合物加入 6 孔板中，補足 RPMI1640 培養液至 2 mL，37 ℃ 、5%CO2條件下培養 48 h 后提取蛋白質。

1.2.4 RT-qPCR 收集 Hela、7702、hcclm3、SMMC7721、PLC/PRF5、 HepG2、 7703、 Huh7、 Bel-7402 細 胞， 用Trizol法提取總 RNA，反轉錄后進行 RT-qPCR 擴增，反應 體 系 為 20 μL； RT-qPCR 檢測 細 胞 中 MEF2D mRNA、MIG6 mRNA 表達水平。 Hela 細胞在此被作為陽性對照是因為該細胞已經被驗證可以表達MEF2D[3]。 GAPDH 作為內參，每次實驗均做 3 個重復孔。 最后以細胞中的 MEF2D mRNA 表達量作為橫坐標，以 MIG6 mRNA 表達量作為縱坐標，制作線性相關圖。 引物序列見表1。

1.2.5 細胞增殖能力檢測實驗 7Sea-CCK 法檢測細胞增殖能力。 在 96 孔板中接種細胞懸液，每孔約2×103個細胞；轉染 NC 組、siMIG6 組、siMEF2D 組、si2M 組后，分別于 0、24、48、72 h 檢測；檢測時每孔加入 10 μL 7Sea-CCK 溶液，并確保起始培養體積為100 μL，37 ℃ 細胞培養 箱 孵 育 1 h， 用酶 標儀 檢測450 nm 處的光密度(optical density，OD) 值，以不含細胞的等體積空白培養基孔作本底，繪制細胞生長曲線，實驗重復 3次。

1.2.6 細胞劃痕實驗 將細胞接種于 6 孔板于 37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞匯合率達 70% ～80%時，使用 200 μL 槍頭比著直尺垂直用力劃橫線；用磷酸緩沖液沖洗 3 遍后，分別轉染 NC 組、si-MIG6 組、siMEF2D 組、si2M 組，加入無血清的 RPMI 1640 培養液進行培養；分別于 0、48 h 用倒置顯微鏡觀察遷移效果并拍照，實驗重復 3 次；應用 Image Pro Plus 軟件分別測量 0 h 和 48 h 時 PLC/PRF5 細胞劃痕圖的面積和高度，計算細胞遷移率。

1.2.7 蛋白質印跡檢測 肝癌細胞 PLC/PRF5 和SMMC7721 轉染 48 h 后，收集新鮮細胞加入細胞裂解液，低溫高速離心 (4 ℃ 、12 000 r/min、30 min) ，提取細胞總蛋白。 BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定后，相等蛋白上樣量進行 10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜至聚偏氟乙烯上；加入由 Tris 緩沖鹽溶液和吐溫-20(Tris Buffered Saline with Tween-20，TBST) 配制的 5%脫脂奶粉封閉 1 h，加入一抗，4 ℃ 搖床過夜孵育，TBST漂洗 3 次，每次 10 min；加入相應的二抗，室溫孵育1 h，TBST 漂 洗 3 次， 每 次 10 min。 膜 上 滴 加 發 光液，1 min 后通過化學發光成像系統( 法國 Vilber 公司 Solo 4S) 顯色，實驗重復 3 次以上；應用 ImageJ 軟件測量灰度值分別檢測 PLC/PRF5 和 SMMC7721細胞中 MIG6 和 MEF2D 蛋白的表達量。

1.3 統計學處理 應用 SPSS 19.0 軟件，計量資料以均數±標準差(ˉx±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間進行比較采用 t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MEF2D mRNA、MIG6 mRNA 在肝癌細胞中的表達 正常肝細胞 7702 不表達 MEF2D，肝癌細胞Bel-7402、Huh7 中 MEF2D mRNA 表達水平很高，但MIG6 mRNA 表達水平卻不高；肝癌細胞 hcclm3 中不表達 MEF2D mRNA，而 MIG6 mRNA 表達水平卻很高(圖 1)。 線性相關圖中發現肝癌細胞 hcclm3、SMMC7721、 PLC/PRF5、 HepG2、 7703、 Huh7、 Bel-7402 中 MIG6 mRNA、MEF2D mRNA 表達水平呈現負相關關系(r=-0.78，圖 2)。

2.2 下調 MIG6 和 MEF2D 后對肝癌細胞增殖的影響 不同時間點組間單因素方差分析見表 2。 24 h和 48 h 時，下調 MIG6 或 MEF2D 后，與 NC 組比較，siMIG6 組和 siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細胞增殖能力無顯著變化；同時下調 MIG6 和 MEF2D 后，與siMEF2D 組比較，si2M 組中 PLC/PRF5 細胞增殖能力無顯著變化。 72 h 時，各組間方差分析差異有統計學意義(F=20.68、P ＜ 0.01)，下調 MIG6 后，與NC 組比較，siMIG6 組中 PLC/PRF5 細胞增殖能力顯著增強，差異有統計學意義(OD=3.73±0.18，t= 3.84、P=0.02)；下調 MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細胞增殖能力顯著下降，差異有統計學意義(OD=1.79±0.22，t=3.95、P= 0.02)；同時下調 MIG6 和 MEF2D 后， 與 siMEF2D組比較，si2M 組中 PLC/PRF5 細胞增殖能力增強，差異有統計學意義(OD=2.99±0.03，t=4.83、P＜0.01)。 見圖 3。

2.3 下調 MIG6 和 MEF2D 后對肝癌細胞遷移的影響 各組間方差分析差異有統計學意義(F=42.27、P＜0.01) 。 48 h 時，下調 MIG6 后，與 NC 組比較，si-MIG6 組中 PLC/PRF5 細胞遷移能力顯著增強，差異有統計學意義[細胞遷移率為(51±4)%，t=3.22、P＜0.05]；下調 MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中 PLC/PRF5 細胞遷移能力顯著下降，差異有統計學意義 [ 細胞遷移率為 (19 ± 3)%， t=7.70、 P ＜0.01]；同時下調 MIG6 和 MEF2D 后， 與 siMEF2D組比較，si2M 組中 PLC/PRF5 細胞遷移能力增強，差異有統計學意義[細胞遷移率為(46±3)%，t= 6.99、P＜0.01]。 見圖 4。

2.4 肝癌細胞中下調或上調 MEF2D 后對 MIG6的蛋白表達水平的影響 肝癌細胞 PLC/PRF5 和SMMC7721 中 MEF2D 和 MIG6 的蛋白灰度值見表3、4。 下調 MEF2D 后，與 NC 組比較，siMEF2D 組中PLC/PRF5 細胞 MIG6 蛋白表達水平顯著上升，差異有統計學意義(t=7.86、P＜0.001)；上調 MEF2D后，與空載對照組比較，MEF2D 組中 SMMC7721 細胞 MIG6 蛋白表達水平顯著下降，差異有統計學意義(t=4.61、P=0.004)。 見圖 5。

3 討論

MIG6 是一個獨特的、即刻早期反應基因。 它作為一個接頭蛋白，通過與上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR) 胞內部分直接結合來抑制其酪氨酸激酶酶活性，是 EGFR 通路重要的負反饋調控因子[4-5]。 MIG6 在多種腫瘤細胞中表現為下調，甚至在多種人類腫瘤中都表現出高頻率的等位基因缺失[6]。 已有研究表明，MIG6 可以抑制六價鉻導致的 DNA 損傷且阻止人肺上皮細胞的轉化，降低肺致癌的可能性[7]。 MIG6 也可以作為一個關鍵的腫瘤抑制子阻止子宮內膜癌的發生[8]。MIG6 的下調能促進肝癌細胞的遷移能力，促進肝癌細胞的增殖及抑制凋亡[9]。 本研究中，下調 MIG6后，發現肝癌細胞 PLC/PRF5 和 SMMC7721 的增殖能力和遷移能力均顯著增強，說明該基因在肝癌中起到一個抑癌基因的角色。 MEF2D 屬于轉錄調節因子 MADS-box 家族，最初被認為是肌細胞特異性DNA 結合蛋白，多結合在許多肌特異性基因的調控區域控制轉錄過程，在多種發育和生理過程中發揮重要功能[10]。 目前大量的研究已證實，MEF2D 參與了多種細胞的信號傳導過程。 在白血病中，MEF2D可與其他基因形成融合基因導致染色體易位，形成異常的信號轉導通路，從而促使白血病形成和發展[11-12]。 在癌細胞中，MEF2D 還可以受到很多微小RNA(microRNA，miRNA) 的調控，如在胃癌細胞中，miR-19 可以抑制 MEF2D 的表達并抑制 Wnt/β-catenin通路的激活[13]； 在肺 癌細胞中， miR-218 也可以直接抑制 MEF2D 的表達來抑制肺癌細胞的增殖[14]。除此之外，MEF2D 在調節癌細胞分化、增殖和存活等方面也發揮著重要的作用[15-16]。

近幾年，一些 MEF2D 是如何直接調控腫瘤生物學功能的研究機制也陸續報道。最近已有研究表明，MEF2D 能將微環境刺激傳達給 E 盒結合鋅指蛋白 1，促進結直腸癌細胞的上皮-間充質細胞轉化和轉移[17]；MEF2D 也可以通過結合 Pokemon 基因的啟動子區域促進其轉錄，兩者協同可以促進肝癌細胞的浸潤[18-19]。 然而，MEF2D 與 MIG6 之間的調控關系在此之前鮮見報道。 本研究表明，在肝癌細胞中 MEF2D mRNA、MIG6 mRNA 表達 水平 呈現 負相關關系，提示 MEF2D 和 MIG6 之間可能存在著某種調控關系。本研究首先通過細胞增殖檢測實驗和細胞劃痕實驗檢測了分別下調 MEF2D 或 MIG6 后肝癌細胞 PLC/PRF5 的增殖和遷移能力，結果與文獻報道保持一致[9]。 然后，在肝癌細胞 PLC/PRF5 中同時下調 MEF2D 和 MIG6 后，發現同時下調 MEF2D和 MIG6 后消除了單下調 MEF2D 對肝癌細胞 PLC/ PRF5 增殖和遷移的抑制能力，表明 MEF2D 與 MIG6之間確實存在負調控關系。 最后，通過蛋白質印跡法進行驗證，在 PLC/PRF5 細胞中下調 MEF2D 后，MIG6 的蛋白表達水平明顯上升；在 SMMC7721 中上調 MEF2D 后，MIG6 的蛋白表達水平顯著下降。 提示 MEF2D 也許可以通過結合 MIG6 基因的啟動子區域的順式作用元件來促進其轉錄。

在今后的工作中應繼續探討 MEF2D 負向調控MIG6 的作用機制，進一步確定 MEF2D 是否結合并通過 MIG6 啟動子上游順式作用元件來調控靶基因的轉錄。 由于 MEF2D 和 MIG6 在腫瘤中起到的關鍵作用，關于兩者作用機制的深入研究對肝癌的靶向治療具有重大意義。

[1]Ma L，Liu J，Liu L，et al.Overexpression of the transcription factor MEF2D in hepatocellular carcinoma sustains malignant character by suppressing G2-M transition genes [J].Cancer Res，2014，74(5):1452-1462.

[2]Maity TK，Venugopalan A， Linnoila I，et al.Loss of MIG6 accelerates initiation and progression of mutant epidermal growth factor receptor-driven lung adenocarcinoma[J]. Cancer Discov，2015，5(5):534-549.

[3]Ornatsky OI，McDermott JC.MEF2 protein expression， DNA binding specificity and complex composition，and transcriptional activity in muscle and non-muscle cells[J].J Biol Chem，1996，271(40):24927-24933.

[4]Yu XD， Yang R， Leng CJ.Truncation， modification， and optimization of MIG6(segment 2)peptide to target lung cancer-related EGFR[J].Comput Biol Chem， 2016， 61 (2):251-257.

[5]Izumchenko E，Sidransky D.Understanding the MIG6-EGFR signaling axis in lung tumorigenesis[J].Cancer Discov，2015，5(5):472-474.

[6]Tseng RC，Chang JW，Hsien FJ，et al.Genomewide loss of heterozygosity and its clinical associations in non small cell lung cancer[J].Int J Cancer，2005，117(2):241-247.

[7]Park S，Li C，Zhao H，et al.Gene 33/Mig6 inhibits hexavalent chromium-induced DNA damage and cell transformation in human lung epithelial cells[J].Oncotarget，2016，7 (8):8916-8930.

[8]Kim TH，Lee DK，Cho SN，et al.Critical tumor suppressor function mediated by epithelial Mig-6 in endometrial cancer[J].Cancer Res，2013，73(16):5090-5099.

[9]Reschke M， Ferby I， Stepniak E， et al.Mitogen-inducible gene-6 is a negative regulator of epidermal growth factor receptor signaling in hepatocytes and human hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，2010，51(4):1383-1390.

[10]Potthoff MJ， Olson EN.MEF2:a central regulator of diverse developmental programs[J].Development，2007，134 (23):4131-4140.

[11]Lilljebj?rn H，?gerstam H，Orsmark-Pietras C，et al.RNA-seq identifies clinically relevant fusion genes in leukemia including a novel MEF2D/CSF1R fusion responsive to imatinib[J].Leukemia，2014，28(4):977-979.

[12]Suzuki K，Okuno Y，Kawashima N，et al.MEF2D-BCL9 fusion gene is associated with high-risk acute B-cell precursor lymphoblastic leukemia in adolescents[J].J Clin Oncol，2016，34(28):3451-3459.

[13]Xu K，Zhao YC.MEF2D/Wnt/β-catenin pathway regulates the proliferation of gastric cancer cells and is regulated by microRNA-19[J].Tumour Biol，2016，37(7):9059-9069. [14]Song L，Li D，Zhao Y，et al.miR-218 suppressed the growth of lung carcinoma by reducing MEF2D expression[J]. Tumour Biol，2016，37(3):2891-2900.

[15]Yu H，Sun H，Bai Y，et al.MEF2D overexpression contributes to the progression of osteosarcoma[J].Gene，2015， 563(2):130-135.

[16]Zhang M， Truscott J， Davie J.Loss of MEF2D expression inhibits differentiation and contributes to oncogenesis in rhabdomyosarcoma cells[J].Mol Cancer， 2013， 12(1): 5492-5500.

[17]Su L，Luo Y，Yang Z，et al.MEF2D transduces microenvironment stimuli to ZEB1 to promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in colorectal cancer[J]. Cancer Res，2016，76(17):5054-5067.

[18]Hong X，Hong XY， Li T， et al.Pokemon and MEF2D cooperationally promote invasion of hepatocellular carcinoma [J].Tumour Biol，2015，36(12):9885-9893.

[19]Kong J，Liu X，Li X，et al.Pokemon promotes the invasiveness of hepatocellular carcinoma by enhancing MEF2D transcription[J].Hepatol Int，2016，10(3):493-500.

Myocyte enhancer factor 2D promotes the proliferation and migration of hepatoma cells PLC/PRF5 and SMMC7721 by negatively regulating mitogen-induced gene 6 expression

CHEN Xiao1， LIN Zhijuan1， LI Mengpeng1， CHEN Chao1， WANG Jianxun1， LIU Jia2， LI Peifeng1
(1.Institute for Translational Medicine， Qingdao University， Qingdao Shandong 266071， China；2.School of Pharmacy， Qingdao University， Qingdao Shandong 266071， China)

ObjectiveTo study the effects of myocyte enhancer factor 2D(MEF2D)on proliferation and migration of hepatoma cells PLC/PRF5 and SMMC7721， and regulating the expression ofmitogen-induced gene 6(MIG6).MethodsThe mRNA levels of MEF2D and MIG6 were detected by real time fluorescence quantitative PCR in hcclm3， SMMC7721， PLC/PRF5， HepG2， 7703，Huh7， Bel-7402 cell lines and we drew a linear correlation diagram with “ MEF2D mRNA expression” on the horizontal axis and “ MIG6 mRNA expression” on the vertical one in these hepatoma cell lines.The expression of MEF2D and MIG6 were down-regulated by small interfering RNA(siRNA)，then the proliferation and migration were observed by 7Sea-Cell Counting Kit(7Sea-CCK)and wound healing assay in PLC/PRF5 cell lines.The expression of MEF2D and MIG6 were detected by western blot after MEF2D down-regulated by siRNA in PLC/PRF5 cell lines or up-regulated by plasmid in SMMC7721 cell lines.The experimental were divided into seven groups:negative control (NC)group， siMIG6 group， siMEF2D group， si2M(both MEF2D and MIG6 were down-regulated) group ， blank group， empty vector plasmid group and MEF2D group.ResultsWe found that the level of MEF2D mRNA was negatively correlated with expression of MIG6 mRNA in hcclm3，SMMC7721， PLC/PRF5， HepG2， 7703， Huh7， Bel-7402 cell lines(r=-0.78).Next， the results analyzed by 7Sea-CCK showed that the proliferation ability was significantly enhanced at 72 h after siMIG6 treatment compared with NC group in PLC/PRF5 cell lines(OD=3.73±0.18， t=3.84， P= 0.02) ， while there was no change at 24 h and 48 h.However， the proliferation ability was significantly suppressed at 72 h under MEF2D knockdown condition in PLC/PRF5 cell lines compared NC group(OD=1.79 ± 0.22， t=3.95， P=0.02) ， but the proliferation ability was significantly increased at 72 h under MEF2D and MIG6 both knockdown condition compared with siMEF2D group (OD=2.99±0.03， t=4.83， P ＜ 0.01).Furthermore， wound healing assay revealed that the cell mobility in siMIG6 group was significantly increased[cell mobility=(51±4)%， t=3.22， P＜0.05] at 48 h compared with NC group and the cell mobility in siMEF2D group was significantly reduced [cell mobility=(19±3) ， t=7.70， P＜0.01]in PLC/PRF5 cell lines， but the cell mobility in si2M group was significantly increased at 48 h compared with siMEF2D group[cell mobility=(46±3)%，t=6.99， P＜0.01].The result of western blot showed that， compared with NC group， the expression of MIG6 was significantly increased under MEF2D siRNA treatment in PLC/PRF5 cell lines(t= 7.86， P ＜ 0.001) ， while its level was significantly decreased by the elevated level of MEF2D in SMMC7721 cell lines(t=4.61， P=0.004).ConclusionThe expression of MEF2D was negatively correlated with the level of MIG6 of PLC/PRF5 and SMMC7721 cell lines.Thus， MEF2D promotes the proliferation and migration of PLC/PRF5 and SMMC7721 cell lines possibly through negatively regulating MIG6 expression.

Myocyte enhancer factor 2D(MEF2D) ； Mitogenin-duced gene 6(MIG6) ；Hepatocellular carcinoma； Negative regulation； Cell proliferation； Cell migration

Q522；R329.2＋8；R735.7

A

2095-3097(2017)01-0006-07

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.002

2016-12-01 本文編輯:張在文)

國家自然科學基金青年項目(81502065)；山東省自然科學基金青年項目(ZR2014HQ009)；中國博士后科學基金特別資助項目(2016T90613)；中國博士后科學基金面上項目(2015M580574)；山東省博士后創新項目(201602037)；青島市自主創新計劃應用基礎研究項目(16-5-1-56-JCH)；青島市博士后應用研究項目(2015167)

266071 山東 青島，青島大學轉化醫學研究院(陳 瀟，林志娟，李孟鵬，陳 超，王建勛，李培峰)，藥學院(劉 佳)

劉 佳，E-mail:dadaliujia＠qdu.edu.cn；李培峰，E-mail:peifli＠qdu.edu.cn