Masson-Fontana銀染色法改良研究

牛繼偉，孫曉軍，孟曉琴，汪占弟，馬莉萍

(蘭州市動物疫病預防控制中心，甘肅 蘭州 730050)

甘肅省首屆獸醫系統征文選登

Masson-Fontana銀染色法改良研究

牛繼偉，孫曉軍，孟曉琴，汪占弟，馬莉萍

(蘭州市動物疫病預防控制中心，甘肅 蘭州 730050)

為簡化常規Masson-Fontana染色法顯示嗜銀細胞的染色流程、縮短染色時間，并獲得良好染色效果，通過研究對改變影響染色效果最為關鍵的氨銀溶液濃度、浸染溫度和時間等因素對該方法進行了改進，經過反復實驗，探索出在60℃水浴中用2.5%氨銀溶液浸染石蠟切片1 h能得到較好的染色效果，嗜銀細胞著色深淺適宜，背景較淺，嗜銀顆粒清晰可辨，細胞核明顯。說明改良后的Masson-Fontana銀染法更為便捷，可以用于嗜銀細胞的染色。

嗜銀細胞；Masson-Fontana；銀染色法

胃腸道黏膜中散在著多種內分泌細胞，它們具有共同的細胞化學特點，都具有產生胺類和肽類激素的功能[1-3]。由于這些細胞產生的胺類和肽類激素都貯存在胞漿中的分泌顆粒中，可以采用組織化學染色中的親銀和嗜銀染色來顯示，因此這些細胞通常都被稱為嗜銀細胞[4]。目前主要采用免疫組化或特殊的銀染方法來顯示這些細胞。然而，從經濟角度、操作的簡易程度及染色的綜合效果來看，特殊的銀染方法仍不失為一種經濟、簡便而又實用的顯示方法，受到了廣大科研工作者的普遍認可。在眾多的銀染色法中，Masson-Fontana銀染色法以其結果相對穩定、非特異性著色少等特點而被廣泛使用[5-7]。然而，常規 Masson-Fontana染色法顯示嗜銀細胞時需要在氨銀溶液中浸染12～18 h或更長時間[8-9]，這樣不僅耗時，而且也會增加掉片的幾率。

1 材料與方法

1.1 切片標本的制備

健康雙峰駝皺胃賁門腺區新鮮組織，經10%中性福爾馬林溶液固定，按照常規方法制作石蠟切片。

1.2 氨銀溶液的配制

取10%硝酸銀水溶液20 mL，逐滴加入濃氨水，邊加邊搖晃，直到產生的沉淀逐漸溶解為止，再滴加10%硝酸銀水溶液數滴至溶液呈輕度混濁為度。此溶液可短期保存，但最好臨用前現配制。使用前稀釋成合適濃度過濾后使用。為摸索出氨銀溶液的最佳工作濃度，本實驗中將此溶液分別用蒸餾水稀釋成5%、2.5%、1.25%、0.6%、0.3%5個濃度進行對比實驗。

1.3 方法

石蠟切片常規脫蠟至蒸餾水洗，分別進行如下實驗。將第一批切片入以上不同濃度氨銀溶液，置于室溫下避光浸染18 h，蒸餾水洗，加0.2%氯化金水溶液調色2～3 s，蒸餾水洗，再入5%硫代硫酸鈉水溶液固定5 min，用蒸餾水洗，Van Gieson氏染液復染1～2 min，95%乙醇急速分化數秒，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡下觀察；第二批切片入預熱至40℃或60℃的不同濃度氨銀溶液中，分別進行30 min，1～2 h避光浸銀反應，試圖找到最佳浸銀反應濃度、溫度和時間，其他步驟同第一批。

2 結果

2.1 氨銀溶液的濃度對浸銀染色的影響

不論是用常規Masson-Fontana染色法，還是用經過改良的染色法，2.5%的氨銀溶液染色效果較好，背景較淺，細胞著色深淺適宜，嗜銀顆粒清晰可辨，細胞核也明顯可見。高倍鏡下可見胃賁門腺腺體中的嗜銀細胞主要位于腺體基部的腺體細胞之間，胞漿中有大量的分泌顆粒被還原的銀鹽染成棕黑色，細胞大多單個夾于其他上皮細胞之間，呈不規則的錐體形、圓形或梭形，胞核圓形，位于細胞中央或一側（見圖1）。

圖1 2.5%氨銀溶液60℃避光作用1 h后胃賁門腺內的嗜銀細胞(改良Masson-Fontana銀染色法，×400)

2.2 氨銀溶液溫度和浸染時間對染色效果的影響

研究發現，用預熱的氨銀溶液60℃避光作用1 h后，浸銀染色效果最佳。隨著溫度的升高和時間的延長，嗜銀細胞和背景組織著色太深，嗜銀顆粒相互融合，使得整個嗜銀細胞呈均質的黑色，細胞核也不清楚（見圖2）。

3 討論

研究證實，在相同溫度和時間下，2.5%的氨銀溶液濃度染色效果較好，氨銀溶液濃度高于該濃度或是低于該濃度染色效果都不及該濃度染色效果好。氨銀溶液濃度高使得背景組織和嗜銀細胞著色太深，不易于觀察結果。氨銀溶液濃度低使得部分嗜銀細胞不能充分與氨銀溶液作用，導致著色率下降。2.5%的氨銀溶液染色效果較好，背景較淺，細胞著色深淺適宜，嗜銀顆粒清晰可見，細胞核也明顯可見。

圖2 2.5%氨銀溶液室溫下浸染18 h后胃賁門腺內的嗜銀細胞(Masson-Fontana銀染色法，×400)

本研究中，用Van Gieson氏染液復染切片1～2 min，組織背景呈淡紅色，與黑色的嗜銀細胞形成明顯的對比和反差，與不復染的切片相比效果更佳，更易于觀察。

綜上所述，改良后的Masson-Fontana銀染法較傳統方法更省時省力，能夠得到滿意的染色效果，可以被廣泛用于科學研究和臨床檢測中。

[1] Pearse A G.The diffuse neuroendocrine system and the APUD concept:related“endocrine”peptides in brain，intestine, pituitary,placenta，and anuran cutaneous glands[J].Med Bio，1977,(3).

[2] 胥維勇,楊群,范小莉.顯示神經內分泌細胞的染色方法[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2006,（1）.

[3] 王新亭.神經內分泌細胞浸銀染色方法的探討與應用[J].徐州醫學院學報,2000,(2).

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[8] Bancroft J D.Theory and practice of histological techniques[M].Edinburgh London,New York:Churchill Living-stone,1980.

[9] 張哲,陳輝.實用病理組織染色技術[M].沈陽：遼寧科學技術出版社,1988.

[本文獲甘肅省首屆獸醫系統征文比賽三等獎]

（編輯：趙鵬飛）

R361.2

B

1006-799X(2016)21-0015-02

牛繼偉（1981-），男，甘肅隴西人，獸醫師，主要從事動物疫病防控研究。