外源NO供體SNP對鹽脅迫下苜蓿葉片POD活性的影響

李易興

（蘭州市漁業技術推廣中心，甘肅 蘭州 730000）

外源NO供體SNP對鹽脅迫下苜蓿葉片POD活性的影響

李易興

（蘭州市漁業技術推廣中心，甘肅 蘭州 730000）

試驗通過對鹽脅迫下苜蓿幼苗葉片分別噴施不同濃度的一氧化氮（NO）供體SNP，研究了SNP對100mmol/L NaCl脅迫下苜蓿幼苗葉片POD活性的影響。結果表明，0.5mmol/L和1.0mmol/LSNP能提高在長時間100mmol/L NaCl脅迫下苜蓿幼苗葉片POD活性，其通過減輕細胞膜脂過氧化程度，維持質膜結構穩定性，從而減小損傷程度，對損傷具有較好的緩解作用；0.1 mmol/L和0.2 mmol/L的SNP對POD活性影響不明顯，無明顯緩解效果。說明SNP對POD活性的調節和植物的保護作用與SNP自身濃度相關，同時，SNP不僅可以通過調節POD活性增強苜蓿抗氧化能力，而且能通過調節其他保護酶類起到對苜蓿的保護作用，緩解鹽脅迫造成的傷害。

SNP；鹽脅迫；苜蓿葉片；POD

紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生豆科牧草，在我國的農業結構調整中，大力發展飼料植物應首推苜蓿。因其具有營養價值高，適口性好，適應性廣等特點，是家畜的優良飼草，也是良好的水土保持植物，在我國農業生產中具有舉足輕重的地位。但因環境條件的影響，苜蓿在生長期內備受鹽堿土壤的脅迫，我國大面積的鹽堿地使苜蓿產業化面臨著如何利用鹽堿土資源合理開發的問題。因此，選擇耐鹽堿的苜蓿品種進行土地改良，創造經濟效益的同時又兼顧生態效益和社會效益，最終產生出適應性好的苜蓿品種成為苜蓿產業化發展的必要保證。通過對苜蓿鹽害或耐鹽機理的研究，利用化學調控手段是提高苜蓿耐鹽性的有效措施之一。

植物遭受逆境脅迫傷害的重要特征之一是活性氧代謝失調，根據McCord和Fridovich（1969）提出的生物自由基傷害學說，在鹽漬、干旱等逆境條件下，植物體內自由基增加，導致脂類發生過氧化，破壞膜系統的結構和功能，使植物細胞不能維持其高度有序的結構而受傷死亡[1]。植物在長期的抗逆過程中形成了自身的保護系統，其中，廣泛存在于植物體中的過氧化物酶POD是活性較高的一種酶，它能使組織中所含的某些碳水化合物轉化成木質素，增加木質化程度，一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。而且發現早衰減產的水稻根系中過氧化物酶的活性增加，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標。同時，過氧化物酶POD作為內源保護系統中的保護酶，是植物內源自由基消除劑，它通過增強或保持自身較高水平的酶活性，使逆境中的植物減輕自由基傷害[2]。

據研究，一氧化氮（NO）是近幾十年來發現的一種新的植物生長調節物質，可使植物的抗逆性有所增強。其對植物具有雙重性作用——保護細胞或毒害細胞，當NO處于較低濃度時對植物細胞具保護作用，當濃度較高時可能造成對細胞的毒害[3]。

本試驗通過測定在鹽脅迫下外源一氧化氮供體（SNP）對苜蓿幼苗葉片POD活性影響，分析不同濃度SNP與植物POD活性的關系，旨在為進一步提高苜蓿的耐鹽性、選育優良品系和飼草生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為紫花苜蓿。

1.2 方法

1.2.1 土壤滅菌、播種及移栽育苗 將育苗所用土壤拌入有機肥料于高壓滅菌鍋25℃滅菌2h，將苜蓿種子均勻地播撒入滅菌后的土壤，用塑料薄膜覆蓋保濕，并置于自然光下培養。期間及時澆水，保持土壤濕度。待生長出子葉后，揭去薄膜于自然光下培養。在長出3～4片真葉時移栽入花盆，于自然光下培養育苗，適時澆水。

1.2.2 供試材料處理 移栽苜蓿幼苗后，待植株生長至8～9幼小葉片，選取生長較一致的植株即可進行處理。首先用不同濃度NO供體硝普鈉50 mL進行葉面噴施，36 h后分別用100 mL含100 mmol/L的NaCl進行鹽脅迫處理，同時在溶液中加入不同濃度NO供體硝普鈉，連續處理3d。設6種試驗處理：CK，用蒸餾水噴施；N，100 mmol/LNaCl脅迫處理；0.1s，含100mmol/LNaCl和0.1 mmol/LSNP溶液；0.2s，含100mmol/LNaCl和0.2mmol /L SNP溶液；0.5 s，含100 mmol/L NaCl和0.5 mmol/L SNP溶液；1.0s，含100 mmol/LNaCl和1.0 mmol/LSNP溶液。每種處理設3個重復。處理1d、2d、3d以及恢復生長第3天分別取樣進行POD酶活性測定。

1.2.3 過氧化物酶POD的測定

1.2.3.1 測定原理 過氧化物酶廣泛存在于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在的條件下，過氧化物酶能催化過氧化氫氧化酚類，產物為醌類化合物，此化合物進一步縮合或與其他分子縮合，產生顏色較深的化合物。本實驗是以鄰甲氧基苯酚（即愈創木酚）為過氧化物酶的底物，在該酶存在下，H2O2可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚，該紅棕色的物質在波長470 nm處有最大光吸收，故可通過測470 nm處的吸光度變化來測定過氧化物酶POD的活性。

1.2.3.2 實驗主要儀器 研缽；100 mL燒杯；冷凍離心機；電子天平；電熱恒溫水浴鍋；分光光度計等。

1.2.3.3 實驗主要試劑 50 mmol/L pH7.8的磷酸緩沖液（內含1%聚乙烯吡咯烷酮）；愈創木酚；30%H2O2；50 mmol/LpH6.0的磷酸緩沖液。

1.2.3.4 測定方法

提取酶液：稱取苜蓿幼苗葉片0.25 g，于預冷的研缽中，并加入預冷3 mL的50 mmol/L pH7.8的磷酸緩沖液（內含1%聚乙烯吡咯烷酮）和少量石英沙研磨成勻漿，轉入離心管，再用2 mL上述磷酸緩沖液沖洗研缽轉入離心管于4℃下10 000 r/min離心15 min，離心所得上清液即為POD粗提液。

配制反應液：取100 mL pH6.0的磷酸緩沖液，加入56 μL愈創木酚，加熱溶解后冷卻，再加入38 μL 30%H2O2，混合均勻保存于冰箱中備用。

POD測定：取光程為1 cm的玻璃比色杯2只，一只加入反應液3 mL，50 mmol/L磷酸緩沖液1 mL作為調零管。另一只加入反應液3 mL，提取的粗酶液1 mL，立即開始計時，在470 nm波長處進行比色，開始記錄數據，然后每隔半分鐘記錄一次吸光度值，共測2 min。測定結果按以下公式計算POD活性。

過氧化物酶活性=（△A470*VT）*（0.01FW*Vs*t）-1，其中：

A470——反應時段內吸光值的變化；FW——樣品鮮重（g）；VT——提取酶液總體積（mL）；Vs——測定時取用酶液體積（mL）；每分鐘內A470變化0.01為1個過氧化物酶活力單位（U）。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫前SNP對POD活性的影響

圖1 NaCi處理前SNP對苜蓿幼葉片POD活性的影響

由圖1可以看出，對照CK為僅用蒸餾水處理的植株，其表現正常生長下苜蓿葉片的POD活性，它顯著低于4種SNP處理（P＜0.01），所有SNP處理中0.1 s處理的POD活性顯著高于其他SNP處理（P＜0.01），0.2 s、0.5 s、1.0 s處理依次降低。說明與對照相比，在正常生長條件下，4種濃度的SNP單獨處理可以顯著提高苜蓿POD活性（P＜0.01），其中以0.1 mmol/L SNP對酶活性的提高效果最好，0.2 mmol/L，0.5 mmol/L，1.0 mmol/LSNP對POD活性的影響都顯著低于0.1 mmol/LSNP（P＜0.01）。

圖2 鹽脅迫對苜蓿幼苗葉片POD活性的影響

2.2 鹽脅迫對POD酶活性的影響

由圖2可以看出，在進行NaCl脅迫初期（0～24 h）POD活性顯著升高，隨著脅迫的持續，脅迫時間的增長，48 h后POD活性下降極顯著（P＜0.01），較24 h測定時下降92.4%，72 h后測定酶活性較48 h升高3倍多（336.6%），但仍顯著低于24 h測定值（P＜0.01）。與CK相比，N處理的POD活性始終顯著高于同時段的CK（P＜0.01）。由此可知，POD活性在脅迫初升高是因為植物自身的保護系統通過提高內源保護酶活性來抵抗外界環境脅迫，而長時間的鹽脅迫使植物細胞過度損傷，膜系統無法繼續維持其穩定性，但可能由于苜蓿本身具有耐鹽特性，加之幼苗期植株生長較快，能夠緩解100 mmol/L NaCl脅迫，在脅迫72 h時體現出POD活性的上升。

2.3 SNP對苜蓿幼苗鹽脅迫下POD活性的影響

圖3是6種試驗處理的苜蓿幼苗葉片的POD活性測定值圖示，其中圖3-A示不同濃度SNP+100 mmol/LNaCl處理苜蓿24 h時的測定值，從圖中可知，N處理顯著高于CK和4種SNP處理（P＜0.01），SNP處理中0.2 s顯著高于0.1 s、0.5 s、1.0 s處理，但都顯著低于CK（P＜0.01），說明苜蓿具有的自身抗鹽性使其在100 mmol/L NaCl脅迫下能通過提高內源保護酶POD活性增強抗氧化能力，緩解脅迫傷害。4種濃度的SNP處理其POD活性低于單獨鹽脅迫處理可能是因為：苜蓿葉片在濃度為100 mmol/L鹽脅迫下，POD不是SNP緩解脅迫的主要作用目標，所以SNP對POD活性影響不太明顯，它可以通過調節其他保護酶的活性抵抗此濃度的鹽脅迫，本試驗室也證實，SNP可提高100 mmol/LNaCl脅迫下的苜蓿葉片CAT活性，而對SOD活性影響不明顯。

圖3-B示不同濃度SNP+100mmol/L NaCl處理苜蓿48h時的POD測定值，可以看出，N處理和SNP處理顯著高于CK（P＜0.01），SNP處理中0.5s顯著高于其他，1.0s次之，二者都顯著高于0.1s和0.2s（P＜0.01），但所有處理整體低于24h時測定值，說明SNP+NaCl處理48h時與對照相比，POD活性有所提高，SNP已經對鹽脅迫下的苜蓿產生了一定保護作用，以0.5 mmol/L效果最好，1.0mmol/L次之。但因為鹽脅迫時間較長，植物內源保護酶POD的抗氧化能力不再增強，不能繼續維持膜系統的穩定性，細胞損傷較重。

圖3 NaCl+SNP分別處理24 h、48 h、72 h時與CK和N處理間苜蓿幼苗葉片POD活性的比較

圖3-C示不同濃度SNP+100 mmol/LNaCl處理苜蓿72h時的POD測定值，其中N處理POD活性顯著高于CK（P＜0.01）和4種SNP處理（P＜0.01），0.5 s、1.0 s仍處于SNP處理中的最高水平，顯著高于0.1s和0.2s。由N處理可知苜蓿自身的抗鹽性使脅迫處理后期POD活性仍能保持在高于CK的水平。同時，0.5mmol/L和1.0 mmol/L SNP對長時間100 mmol/L鹽脅迫下的苜蓿POD活性提高較0.1 mmol/L和0.2 mmol/L的低濃度SNP效果好，說明0.5 mmol/L和1.0 mmol/L SNP能夠較好緩解長時間100 mmol/L NaCl對苜蓿幼苗葉片的膜損傷。

2.4 恢復生長后POD的活性變化

由圖4可以看出，4種SNP處理顯著高于CK，0.5 s、1.0 s和N處理無極顯著差異（P＜0.01），均高于0.1 s和0.2 s處理（P＜0.01），可知在恢復生長3 d后，單獨鹽脅迫處理的苜蓿因為自身較強的抗鹽性POD仍能保持較高活性，恢復較好。0.5 mmol/L和1.0 mmol/L SNP由于具有緩解100 mmol/L NaCl脅迫的作用，所以在恢復生長后仍能使POD活性保持在較高水平，這也是SNP對植物細胞起保護作用的主要原因之一。

圖4 恢復生長后POD活性

3 討論

植物鹽脅迫損傷是植物遭受逆境脅迫傷害中較常見的一種。鹽脅迫可導致植物自身活性氧代謝失調，最終使植物因細胞過渡損傷而死亡。但植物內源保護系統可在一定程度上緩解鹽脅迫造成的傷害。在逆境脅迫下植物體可調動保護系統中的酶類，如POD，用以抵御和消除活性氧，以維持膜系統的穩定性。而NO作為一種活性氮，參與植物生長發育和對環境適應的信號轉導過程，對植物也具有保護作用，但NO的保護作用與其有效生理濃度有關。

本試驗通過設計不同濃度梯度的SNP對鹽脅迫下的苜蓿幼苗葉片的處理，探討NO對葉片POD酶活性的影響。試驗中隨著脅迫時間的增長，SNP逐漸體現出對POD活性的調節作用，試驗證實0.5 mmol/L和1.0 mmol/L SNP對苜蓿幼苗葉片在長時間100 mmol/L NaCl脅迫下產生的損傷具有較好的緩解作用，能提高POD活性，減輕細胞膜脂過氧化程度，從而減小損傷程度，對苜蓿抗鹽脅迫能力具有輔助作用。由試驗測定結果可以得出以下結論：苜蓿生長在具高鹽堿土質的區域，長期的逆境脅迫，加之自然選擇的作用使苜蓿具有較強的耐鹽性，能通過提高內源保護系統中的保護酶活性維持膜系統的穩定性，抵抗外界環境的傷害。

從目前的研究來看，有關植物NO的研究大部分均試圖探討植物是否具有與動物類似的機制，尤其是在植物生長發育、抗病抗逆以及信號轉達等方面。這種類比研究的方法為揭示植物NO的功能和作用機理提供了簡便的途徑，也是未來植物NO研究所采用的主要方法和思路之一。

[1]王學征,韓文灝,于廣建.鹽分脅迫對番茄幼苗生理生化指標影響的研究[J].北方園藝,2004,（3）：48-49．

[2]梁艷榮,胡曉紅,張穎力,等.植物過氧化物酶生理功能研究進展[J].內蒙古農業大學學報（自然科學版）,2003,2（26）：124-132．

[3]牟冬生.一氧化氮的研究進展[J].湖北民族學院學報（醫學版）,2001,18（1）：40-43．

（編輯：高真貞）

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1006-799X(2016)21-0100-03

李易興（1984-），女，甘肅蘭州人，助理工程師，主要從事漁業技術推廣工作。