人尿源性干細胞在口腔組織工程中的應用及研究進展

章茜茹 綜述 陳林 王帥 審校

人尿源性干細胞在口腔組織工程中的應用及研究進展

章茜茹 綜述 陳林 王帥 審校

人尿源性干細胞（Human urine derived stem cells，hUSC）作為一種新的干細胞來源，具有旺盛的增殖能力、高度自我更新能力、良好的多向分化潛能和旁分泌能力，取材無創且無免疫和倫理問題。作為一種理想的干細胞來源，人尿源性干細胞在組織工程和再生醫學領域已經展示了廣闊的應用前景，在泌尿系統疾病、骨組織工程等方面的相關研究，也揭示了hUSC在口腔組織工程中具有應用潛能。本文就尿源干細胞的最新研究成果，及其在口腔組織工程中的應用和研究進展進行綜述。

人尿源性干細胞 口腔組織工程 細胞治療 類器官

口腔頜面部腫瘤、損傷、炎癥等導致的骨折，以及頜面部后天畸形與組織缺損等，嚴重影響了口腔頜面部的功能和患者的面部外觀。干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，可以分化成多種功能細胞，已被廣泛應用于組織工程的研究[1]。理想的細胞來源應該具有取材非侵入性、操作簡單、成本低廉，并且無年齡、性別、族裔或身體情況限制。近年來，一種新型干細胞——人尿源性干細胞（Human urine derived stem cells，hUSC）被發現，hUSC具有良好的多向分化潛能、高度自我更新能力[2]，并且取材無創，無免疫和倫理方面的問題，較之目前運用于口腔組織工程的干細胞，如牙周膜干細胞 （Periodontal ligament cell，PDLC）、 骨髓基質干細胞（Bone marrow stromal cell，BMSC）、牙囊干細胞（Dental follicle stem cell，DFSC）、牙乳頭干細胞（Stem cell from the apical papilla，SCAP）和脂肪細胞（Adipose-derived stem cell，ADSC）等[3]，是一種更為理想的干細胞來源，有望成為口腔再生醫學研究的可靠的細胞來源，以修復和重建口腔關節、骨、軟骨、黏膜、涎腺等組織器官結構和功能。

1 尿源干細胞

將人體新鮮尿液離心，保留離心管底部1 mL液體，并用培養液重懸后種植于培養板，反復擴增后可得到hUSC[4]。hUSC的優點：①取材簡單、成本低廉、無創，每100 mL人新鮮尿液約含有干細胞2.5個[5]。②hUSC具有更高的端粒酶活性和更長的端粒序列，擴增能力強，3~4周即可擴增到1×106個，6~7周能傳至第 4代，數量可達 1×108個[5-6]。③具有

2 尿源干細胞在口腔組織中的應用與研究

目前，hUSC已經顯示了其蘊藏的廣闊的應用前景，在泌尿系統疾病、骨組織工程，以及腦損傷修復等方面，均有相關研究與報道，而在口腔組織工程中的研究與運用尚處于起步階段。

2.1 牙再生方面的應用

近年來，組織工程和干細胞的研究進展為牙列缺損的修復提供了更具吸引力的方法。誘導多能性干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPS）在牙再生領域有極大的運用潛能，但受到細胞來源、增殖能力、分化潛能等限制，仍缺乏合適的種子細胞[14]。Cai等[15]將誘導分化的hUSC注入小鼠腎包膜下，3周后觀察到小鼠腎包膜下長出牙齒樣結構，含有與人體正常牙齒一致的牙釉質、牙本質和牙髓，并含有成釉細胞樣細胞，新生組織的化學組份、物理性質與人正常牙齒高度相似。該研究結果表明，hUSC可用于再生特定的牙組織，是牙再生種子細胞的候選來源。

2.2 口腔頜面部骨組織缺損修復方面的應用

骨組織工程技術修復骨缺損已取得了長足的進展[16]。hUSC可向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞分化， 其各方面的特性優于BMSC，為骨組織工程提供了新的細胞來源。Guan等[17]分析了hUSC分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的能力，發現hUSC分化3周后，茜素紅S和von Kossa染色顯示出無定形鈣礦物沉積的直接證據；免疫熒光顯示，成骨相關蛋白OCN和Runx2的表達在hUSC誘導組中上調。進一步評估hUSC的軟骨形成分化潛能，通過免疫熒光檢測Sox9和Ⅱ型膠原的表達，結果表明hUSC有著顯著的軟骨形成分化能力；將誘導后的細胞接種裸鼠皮下，4周后可見骨樣包塊，組織學證實為骨組織。Bharadwaj等[7]提出通過骨形態發生蛋白（BMP）轉染可提高hUSCs的成骨能力。Guan等[18]證明BMP2能誘導hUSC加速向成骨方向分化，且轉染BMP后hUSC無需其他輔助條件即可向成骨細胞分化，組織學結果顯示，轉染后hUSC在裸鼠皮下形成了新骨。Qin等[19]的研究顯示，適宜濃度的納米銀（AgNP）可以促進hUSC的成骨分化。上述研究均表明hUSC的成骨能力是值得肯定的。hUSC可作為牙周組織再生、修復種植后骨缺損，以及治療顳下頜關節疾病的良好干細胞來源。

2.3 口腔頜面部神經損傷修復方面的應用

中樞神經系統可通過自身內源性干細胞來修復[20]，提示了外源性移植干細胞修復神經損傷的可能性。目前，對于干細胞向神經細胞的分化研究多采用骨髓間充質干細胞、神經干細胞等，Guan等[17]研究了hUSC向神經譜系的分化潛能，顯示了其在體外分化成神經祖細胞的潛力。他們在神經誘導培養基中觀察到顯著的折射性細胞體，表達神經細胞特異性蛋白Sox2和巢蛋白的細胞數量顯著增加，表明hUSC可以分化成神經樣細胞。另有研究發現，hUSCs經神經誘導7 d后，細胞呈現混合細胞群狀態，其中包括神經干細胞、成熟神經元和神經膠質細胞；將hUSC移植于小鼠腦內，3周后大鼠腦組織冰凍切片顯示細胞可從腦損傷移植區遷移至海馬區，說明移植細胞能夠于宿主腦內成功存活、遷移，并分化為神經細胞[21]。因此，hUSC具有分化為神經樣細胞的潛能，對修復頜面部神經損傷具有重要意義。

2.4 口腔頜面部軟組織缺損修復方面的應用

新生血管的生成對傷口愈合具有重要作用。Wu等[22]將含有小鼠血管內皮生長因子（VEGF）基因的腺病毒載體轉染hUSC，然后將細胞與人臍靜脈內皮細胞混合植入裸鼠皮下，發現移植區形成致密的微血管網，且表達了更多的內皮細胞特異性標記物，證明轉染后的hUSC能夠更有效地促進血管生成。Liu等[23]的研究證實，用含有人VEGF165和綠色熒光的腺病毒轉染hUSC，植入裸鼠皮下，觀察到了廣泛血管化，并表達內皮細胞特異性抗原CD31和von Willebrand's因子。將hUSC與復合聚己內酯/明膠電紡納米支架（PCL/GT）結合，移植到體內14 d后，傷口愈合率高于對照組，且皮膚結構完整，上皮化程度高，新生膠原纖排列整齊，新生膠原纖維明顯多于對照組，并可見新生致密毛囊；同時，還發現 hUSC可通過旁分泌作用，在傷口處募集內皮細胞，刺激內皮細胞增殖、遷移，促進血管新生[24]。Yuan等[25]的研究發現，hUSC分泌的外泌體可通過促進大鼠血管生成而加速傷口愈合。綜上所述，hUSC可作為修復皮膚組織損傷的種子細胞，通過與其他誘導因子及支架材料結合加快皮膚創面愈合，可用于口腔頜面部損傷的修復及促進皮瓣轉移的成功率。

2.5 類器官方面的應用

類器官是利用多能干細胞或器官祖細胞，在體外采用3D培養技術進行培養，包含目標器官中至少一種細胞類型，能夠自組裝為器官樣結構，且具有其生理結構和功能特征，是研究疾病發病相關機制、藥物篩選和疾病治療的工具[26]。hUSC可分化為膀胱相關的細胞類型，包括功能性尿路上皮和平滑肌細胞譜系[27]。Wu等[28]將hUSC誘導分化的尿路上皮細胞和平滑肌細胞接種在改良的3D多孔小腸黏膜下層支架上，得到了類似于天然尿道組織的多層黏膜結構。Liu等[29]將hUSC種植在小腸黏膜下層，成功修復了兔尿道缺損，表明hUSC具有構建類器官的潛力，可用于尿道修復及膀胱再造等。而類器官在口腔方面的運用，目前主要集中在涎腺類器官。頭頸部惡性腫瘤的放射治療、舍格倫綜合征或其他原因導致的涎腺分泌功能障礙，可導致口干、繼發性齲、吞咽困難等，嚴重影響患者生活質量[30]。涎腺類器官構建應用的干細胞主要有涎腺來源的干細胞和其他組織來源的干細胞兩大類，而hUSC在膀胱及尿道組織再生方面的研究成果，及其多向分化潛能、取材無創性、無致瘤性等優點，為三維腺涎類器官的構建提供了新的思路和種子細胞的選擇。

3 展望

hUSC作為一個新的理想干細胞來源，在口腔領域的應用報道還較少，其組織來源及其作用機制尚不明確，仍有不少問題需要進一步探索。已有的研究已經顯示了hUSC的諸多優點，在口腔再生醫學領域存在著廣闊的應用前景，相信隨著研究的深入，hUSC有望在口腔組織工程領域獲得重要地位。

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The Research Progress and Application of Human Urine Derived Stem Cells in Oral Tissue Engineering

ZHANG Qianru,CHEN Lin,WANG Shuai．School of Stomatology,Zunyi Medical University;Guizhou Province Key Laboratory of Oral Diseases Research,Zunyi 563000,China.Corresponding author:WANG Shuai(E-mail:nanwangshuai639@126.com).

【Summary】Human urine-derived stem cells (hUSC)have been reported,and regarded as a candidate for seed cells in tissue engineering,which are highly expandable,and have self-renewal capacity,multi-differentiation potential and paracrine properties.More importantly,hUSC can be obtained via a non-invasive,simple way,and are low immunogenic without medical ethics restrictions.hUSC as an ideal source of stem cells,have demonstrated a prosperous progress in scientific research and potential application in the field of tissue engineering and regenerative medicine.The research achievement in urinary system,bone tissue engineering also implies potential applications of hUSC in oral maxillofacial tissue regeneration.In this paper,the application of hUSC in oral tissue engineering and regeneration were reviewed by summarizing domestic and overseas research progress on hUSC.

Human urine derived stem cells;Oral tissue engineering;Cell therapy;Organoids

Q813.1+1

B

1673－0364（2017）06－0340－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.06.011

貴州省科技廳科學技術基金計劃（黔教合基礎[2016]1170）；遵義醫學院博士科研啟動基金。

563000 貴州省遵義市 遵義醫學院附屬口腔醫院，貴州省高等學校口腔疾病研究特色重點實驗室。

王帥（E-mail：nanwangshuai639@126.com）。良好的多向分化潛能，可分化為尿路上皮細胞、尿道平滑肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、骨骼肌細胞、神經樣細胞等。④不存在醫學倫理問題[7]。⑤安全性高，目前尚未發現具有致瘤性，實驗證明將細胞植入腎內3個月未形成畸胎瘤[6，8]。⑥具有免疫調節能力，降低炎癥免疫反應，抑制外周血液單核細胞的增殖，并分泌IL-6和IL-8[9]。利用猿病毒 40大T抗原 （SV40Tag）[10]，溫晟等[11-12]成功構建了SV40Tag永生化hUSC，且證實永生化后的hUSC保持了干細胞的分化潛能，仍能向成骨細胞、成軟骨細胞及成脂肪細胞分化，為組織工程研究提供了穩定的細胞來源。目前，對于hUSC的組織來源尚不明確，該細胞可能來源于腎上皮細胞，或來源于血液中干細胞通過腎小球濾過時漏出到尿液中形成的干細胞[13]。

2017年10月6日；

2017年10月29日）