ER、PR、CD34、P16在乳腺葉狀腫瘤中的表達及預后相關性分析

賈 翠，韓邦彩，何 飛，張錄順△

1.成都醫學院 病理學教研室(成都 610500)；2.成都醫學院 臨床醫學院(成都 610500))

·論 著·

ER、PR、CD34、P16在乳腺葉狀腫瘤中的表達及預后相關性分析

賈 翠1，韓邦彩2，何 飛2，張錄順1△

1.成都醫學院 病理學教研室(成都 610500)；2.成都醫學院 臨床醫學院(成都 610500))

目的 通過分析常規組織學、免疫組織化學蛋白表達，探討有助于乳腺葉狀腫瘤(phyllodes tumors，PTs)預后判斷的指標。 方法 回顧性分析79例乳腺PTs病例的組織學特點，以59例乳腺富細胞型纖維腺瘤病例作為對照，免疫組織化學檢測ER、PR、CD34、P16表達，并隨訪，統計學分析其相關性。結果 79例乳腺PTs按半定量指標進行分級，良性、交界性和惡性PTs分別占58.2%、29.1%和12.7%。隨訪結果表明，乳腺PTs病例的局部復發率為20.0%(14/70)，中位復發時間為24個月。乳腺富細胞型纖維腺瘤的局部復發率為9.8%(5/51)，中位復發時間為45個月。ER、PR在乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤的間葉性腫瘤細胞中均未見表達。CD34在乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤中的陽性率分別為57.0%、89.8%；P16在乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤中的陽性率分別為53.1%、23.7%。差異均有統計學意義(P<0.05)。預后分析顯示，CD34陽性率與乳腺PTs病例局部復發有顯著相關性(P=0.001)。結論 CD34和P16有助于乳腺PTs和乳腺富細胞型纖維腺瘤的鑒別診斷，CD34是預測乳腺PTs預后有價值的指標。

乳腺腫瘤； 葉狀腫瘤； 纖維腺瘤； 預后

乳腺纖維上皮性腫瘤包括一組從良性到惡性的乳腺雙相性腫瘤，基于組織學特征分為：乳腺成人型纖維腺瘤、幼年型纖維腺瘤、復雜型纖維腺瘤和乳腺葉狀腫瘤(phyllodes tumors，PTs)。幼年型纖維腺瘤多見于青春期女性，其中少數(<5%)體積巨大的腫瘤也稱為巨大纖維腺瘤，組織學上間質細胞較豐富，常見導管內上皮增生，研究[1]將此類腫瘤命名為細胞型纖維腺瘤。乳腺PTs較為少見，占乳腺原發腫瘤的0.3%～1.5%，占乳腺纖維上皮性腫瘤的2.5%[2]。乳腺PTs很難和纖維腺瘤相鑒別，尤其是管內型纖維腺瘤和細胞型纖維腺瘤，二者的臨床處理方式和預后也不一致，因此需要準確鑒別。有關乳腺PTs和纖維腺瘤的起源和相關性一直是研究人員關注的熱點，但目前有關這方面的研究報道不多[3-4]。乳腺PTs的正確診斷非常重要，其預后判斷也是臨床關注的重點。復發是乳腺PTs的主要問題之一，目前對于PTs復發的相關因素從腫瘤大小、手術方式、免疫組化、分子遺傳學等多方面的研究[5-6]報道結果不一，甚至互相矛盾。本研究收集了79例乳腺PTs和59例富細胞型纖維腺瘤病例，通過觀察組織學特點、免疫組化檢測蛋白表達，旨在找出二者的鑒別診斷指標；并通過隨訪尋找乳腺PTs潛在的預后指標，同時通過對二者的對比分析，進一步認識乳腺雙相性腫瘤。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2001-2014年在四川省腫瘤醫院進行手術切除的乳腺PTs病例，經兩位乳腺病理醫師復核閱片，最終確定診斷79例，其中良性、交界性和惡性分別為46例(58.2%)、23例(29.1%)和10例(12.7%)。通過四川省人民醫院倫理委員會同意，查閱患者的臨床病理資料并隨訪。患者均為女性。乳腺PTs患者平均年齡40歲，乳腺富細胞型纖維腺瘤患者平均年齡27歲。兩組患者病程從數天至30年，大部分病程在2年內。大體上，良性、交界性和惡性PTs差異不明顯，大多數腫瘤呈結節狀生長，界限清楚，良性和交界性PTs常見寬大的裂隙或舌狀突起形成的典型葉狀結構。就診時乳腺PTs和乳腺富細胞型纖維腺瘤病例腫瘤平均大小分別為4.4、3.1 cm，二者比較，差異無統計學意義，具有可比性(P=0.066)。

1.2 方法

1.2.1 組織學乳腺PTs分級指標 2012年第四版WHO乳腺腫瘤病理診斷藍皮書[7]提供了6個組織學指標[1]：腫瘤邊界狀況、間葉細胞的豐富程度、間葉細胞的異型性、間葉細胞的核分裂象、有無間質過度增生以及有無惡性異源性成分。

1.2.2 免疫組織化學 根據常規HE染色切片，所有病例均挑選有代表性的蠟塊做免疫組化分析，并確保選取的組織中有正常乳腺組織作為內對照。各塊石蠟包埋組織切取4 μM厚的免疫組化空白切片。切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶10 min，高壓修復2 min，加入一抗ER-α(SP1，1∶200)、PR(PgR636，1∶300)、CD34(QBEnd/10，1∶200)和P16(16P04/J02，1∶100)， 均購自Dako公司，修復液EDTA-Tris緩沖液pH9.0，于4 ℃孵育過夜，EnVision二抗(Dako，工作液)37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以 TBS 緩沖液代替一抗作為空白對照。判定染色的標準為：ER和PR陽性信號位于胞核，CD34陽性信號位于胞漿，P16陽性信號位于胞核或胞漿。上述抗體的陽性對照染色強度均記為2+；待測腫瘤細胞無信號記為0，弱于對照記為1+，等于記為2+， 強于記為3+；估算陽性區域的百分比：0和1+判為陰性，≥20% 2+或3+判為陽性。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行Mann-Whitney U檢驗分析組間差異，用Cox比例風險回歸模型進行單因素的RFS生存分析,無復發生存期(recurrence-free survival，RFS)定義為從術后診斷PTs到第1次復發的間隔時間。檢驗水準ɑ設定為0.05。

2 結果

2.1 免疫組化結果

免疫組化標記共138例，乳腺良性、交界性和惡性PTs病例分別為46、23和10例(圖1A)。乳腺細胞型纖維腺瘤病例59例(圖1B)。對10例惡性PTs的病例進行上皮和肌上皮標記結果：間質細胞的CK5/6、CK混、34βE12、Desmin及P63均為陰性，確定乳腺惡性PTs的診斷。

2.1.1 CD34 CD34陽性信號在乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤內均呈條帶狀分布(圖2A～2D)。乳腺PTs組的CD34陽性率為57.0%，富細胞型纖維腺瘤為89.8%，U檢驗結果顯示,二者差異有統計學意義(Z=18.246，P<0.001)。乳腺良性PTs和富細胞型纖維腺瘤比較，差異無統計學意義(Z=5.413，P=0.128)。而乳腺惡性PTs中陽性率為30%，多為弱到中陽性，陽性表達明顯低于良性和交界性PTs，但在乳腺交界性和惡性PTs中CD34表達比較，差異無統計學意義(Z=6.470，P=0.045)(表1)。

圖1 乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤的組織學表達

注：A:良性PTs，細胞密度不一(40×)； B：富細胞型纖維腺瘤，可見類似葉狀結構(200×)

圖2 CD34在乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤中的表達

注:A：良性PTs，間質細胞胞漿可見CD34陽性表達(100×)；B：交界性PTs，上皮周圍的間質細胞胞漿可見CD34陽性表達(100×)；C：惡性PTs，間質細胞胞漿CD34未表達(200×)；D：乳腺富細胞型纖維腺瘤，間質細胞胞漿CD34陽性表達(100×)

表1 CD34在乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤中的表達和分布情況比較[n(%)]

2.1.2 P16 P16主要表達于乳腺PTs上皮下間質腫瘤細胞陽性明顯(圖3A～3C)。乳腺PTs組P16陽性率為53.1%，多為中～強陽性表達；富細胞型纖維腺瘤組陽性率為23.7%，多為弱～中陽性(圖2D)。U檢驗結果顯示，乳腺PTs組和富細胞型纖維腺瘤組間比較，差異有統計學意義(Z=16.405，P=0.001)；富細胞型纖維腺瘤和良性、交界性PTs間比較，差異有統計學意義(Z=13.934、11.500，P=0.003、0.005)(表2)。

圖3 P16在乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤中的表達

注:A：良性PTs，間質細胞可見細胞核P16陽性表達(200×)； B：交界性PTs，上皮周圍的間質細胞可見細胞核P16陽性表達(200×)；C：惡性PTs，間質細胞可見細胞核P16陽性表達(200×)；D：富細胞型纖維腺瘤，間質細胞可見個別P16陽性表達細胞(200×)

表2 P16在乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤中的表達和分布情況比較[n(%)]

2.1.3 ER-α，PR ER-α，PR上皮陽性常見，間質腫瘤細胞未見陽性。

2.2 隨訪和預后

通過電話或信件隨訪。乳腺PTs病例共79例， 70例獲得隨訪結果，9例失訪，回訪率為88.6%；隨訪時間21～168個月，中位隨訪期為65個月。富細胞型纖維腺瘤病例共59例，隨訪51例，8例失訪，回訪率86.4%，隨訪時間24～72個月。

診斷為乳腺PTs后，患者的局部復發率為20.0%(14/70例),其中良性7/41例(17.1%)，交界性4/19例(21.1%)，惡性3/10例(30.0%)，復發時間7～78個月，中位復發時間為24個月，65%病例術后3年內復發。不同分級的乳腺PTs復發率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。乳腺富細胞型纖維腺瘤組復發率為9.8%(5/51例)，與乳腺PTs組比較，差異有統計學意義(Z=6.534，P=0.011)。中位復發時間為47個月。

單因素生存分析結果顯示，CD34與乳腺PTs病例的RFS有關(P<0.01)(圖4)。P16未見有預后提示意義。

圖4 CD34在乳腺PTs中的表達與患者預后(RFS)的關系

3 討論

目前，乳腺PTs分級診斷是基于WHO推薦的6個組織學指標的綜合評估。不同文獻報道的乳腺PTs病例比例略有差異，良性、交界性和惡性PTs占比分別為60%～75%、13%～26%、10%～20%[7]。本組病例中，良性、交界性和惡性PTs占比分別為58.2%、29.1%和12.7%，與文獻報道相仿[7]。乳腺富細胞型纖維腺瘤和PTs都是由上皮和間質組成的雙相性腫瘤，其組織學起源于小葉內和導管周圍間質。在進行乳腺PTs分級診斷時，對于細胞豐富而邊界清楚的一類腫瘤究竟納入乳腺PTs還是富于細胞性纖維腺瘤或幼年型纖維腺瘤，非常困難。因此，筆者從免疫組化的角度出發，試圖找出有助于乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤鑒別診斷的輔助指標。

本研究數據顯示，89.8%的乳腺富細胞型纖維腺瘤病例CD34陽性，乳腺PTs病例表達降低，惡性PTs陽性率僅為30.0%，明顯低于良性和交界性(63.0%和56.5%)。Lee等[8]匯總了100例乳腺梭形細胞癌、纖維瘤病和PTs的間質梭形細胞CD34表達情況, CD34在乳腺正常小葉內間質表達,惡性PTs的間質腫瘤細胞表達明顯降低(25.0%)，良性和交界性為80.0%，梭型細胞癌和纖維瘤病間質不表達。另外對33例乳腺PTs研究發現，CD34在良性PTs中陽性率為85.7%(18/21)，惡性PTs陽性率為16.7%(1/6),交界性PTs陽性率為100%。筆者認為CD34可作為鑒別乳腺PTs和富細胞型纖維腺瘤的指標，同時也是鑒別良、惡性PTs的有效輔助指標，但并不能鑒別良性和交界性PTs。CD34在乳腺纖維上皮性腫瘤中的高表達也提示其間質的梭形細胞可能起源于乳腺小葉內或導管周圍間質。乳腺PTs中CD34的表達低于富細胞型纖維腺瘤，惡性PTs中CD34表達明顯減少，可能與這種成纖維細胞樣細胞的分化程度降低或有其他方向的轉化有關。少量乳腺富細胞型纖維腺瘤病例P16陽性表達，在乳腺PTs間質的腫瘤細胞中P16陽性率為53.1%，高于富細胞型纖維腺瘤(23.7%)，但良、惡性PTs并未見差異。乳腺PTs中P16表達上調的機制尚不清楚。

乳腺富細胞型纖維腺瘤的局部復發率為9.8%，乳腺PTs局部復發率為20.0%，良性、交界性和惡性PTs復發率分別為17.1%、21.1%、30.0%，與文獻報道一致[9]，65%的病例術后3年內復發。既往研究顯示，腫瘤大小(>5 cm)、手術方式、切緣陽性[10]、間質過度增生[11]、核分裂像(≥15/10HPF)[12]、腫瘤細胞異型性[13]、腫瘤性壞死以及浸潤性邊界[14]等可能是與乳腺PTs復發轉移相關的臨床和組織學特點。CD34和預后的關系鮮有文獻報道，本研究結果顯示，CD34陰性的乳腺PTs病例更易發生局部復發，但其具體機制有待進一步研究。

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網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161027.1702.046.html

A Study on the Expression of ER, PR, CD34, P16 in Breast Phyllodes Tumors and their Correlation with Prognosis

JiaCui1,HanBangcai2,HeFei2,ZhangLushun1△.

1.DepartmentofPathology,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofClinicalMedicine,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To analyze the characteristics of protein expressions by the histological and immunohistochemical methods respectively and explore the indexes to evaluate the prognosis of breast phyllodes tumors (PTs). Methods The histological characteristics of 70 cases with breast PTs were reviewed retrospectively and compared with those of the other 59 cases with cellular fibroadenoma. The immunehistochemical staining was used to assess the expressions of ER, PR, CD34 and P16, and the follow-ups were conducted. Then the analyses were made statistically. Results According to the semi-quantitative index recommended by WHO, 58.2% of PTs in the 79 cases were benign tumors, 29.1% were borderline tumors, and 12.7% were malignant tumors. The results of the follow-ups showed that the recurrence rates of 70 cases with PTs and 59 cases with cellular fibroadenoma were 20.0% (14/70) and 9.8% (5/51) respectively, and their median time of recurrence was 24 months and 45 months respectively. There were no positive expressions of ER and PR in the PTs and the mesenchymal tumors of cellular fibroadenoma. The positive rates of CD34 in PTs and cellular fibroadenoma were 57.0% and 89.8% respectively, and those of P16 were 53.1% and 23.7% respectively. The statistical analysis showed that the differences were significant between the two groups (P<0.05). The prognostic analysis showed that the positive rate of CD34 was correlated significantly with the recurrence of breast PTs (P=0.001). Conclusion CD34 and P16 are helpful for the differential diagnosis of breast PTs and cellular fibroadenoma, and CD34 is a valuable index to evaluate the prognosis of PTs.

Breast tumor; Phyllodes tumor; Fibroadenoma; Prognosis

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161207.1048.006.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.002

國家自然科學基金資助項目(No:81401161);成都醫學院?；痦椖?(No:13Z094)

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△通信作者：張錄順，E-mail: 45194424@qq.com