丹參飲水提液絮凝純化產物HPLC指紋圖譜分析

潘美云，鄒艷君，李帆帆，林 勉，麻淑磊*

·藥學研究·

丹參飲水提液絮凝純化產物HPLC指紋圖譜分析

潘美云1，鄒艷君2，李帆帆1，林 勉2，麻淑磊2*

目的 建立丹參飲水提液絮凝純化產物的HPLC指紋圖譜。方法 采用HPLC法，色譜柱為Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)。乙腈為流動相A，0.5%冰醋酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫，0～20 min，5%～15% A；20～60 min，15%～45% A。檢測波長為281 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃。結果 丹參飲水提液絮凝純化物HPLC指紋圖譜標定了9個共有峰，指認8號峰為丹酚酸B，18批樣品的相似度均>0.990。結論 建立的丹參飲絮凝純化物指紋圖譜特征性及專屬性強，可為其質量控制提供參考。

丹參飲；絮凝產物；指紋圖譜

0 引言

丹參飲出自《時方歌括》，由丹參、檀香、砂仁三味藥組成。其中丹參為君，化瘀止痛而不傷氣血；檀香、砂仁為臣藥，檀香辛溫調氣、和胃通絡，砂仁行氣調胃解郁，三藥合用，共奏活血行滯、解郁鎮痛之功。丹參飲在臨床上應用廣泛，可治療冠心病[1-3]、慢性胃炎[4-7]、消化性潰瘍[8-9]、心血管疾病[10-12]、腎功能衰竭[13]等。

本研究以殼聚糖為絮凝劑，對丹參飲水提液進行絮凝純化處理，以HPLC法對18批丹參飲水提液絮凝純化產物進行指紋圖譜采集，以國家藥典委員會的軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”進行數據分析，檢測18批丹參飲絮凝純化產物的相似度，確定絮凝純化工藝的穩定性，為開發丹參飲相關制劑產品提供依據。

1 儀器和試藥

高效液相色譜儀DIONEX U3000(美國賽默飛世爾科技有限公司)，超純水儀Synergy UV system(法國millipore)，智能溶出儀RC806(天津天大天發科技有限公司)，旋轉蒸發儀RV10(上海人和儀器有限公司)，電子分析天平XS-105[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9240A(上海一恒科技有限公司)，恒溫混勻儀MS-100(上海凈信實業發展有限公司)，數控超聲波清洗器KQ-500DB，高速臺式離心機TDZ5-MS(湖南湘儀實驗儀器有限公司)，數顯電子恒溫水浴鍋DK-98-ⅡA(天津泰斯特儀器有限公司)。

丹參(產地：四川，批號：140301)、砂仁(產地：廣東，批號：140501)、檀香(產地：云南，批號：140501)購自溫州市華宇中藥飲片有限公司。丹酚酸B對照品(批號：11562-201009，含量：93.7%)購自中國食品藥品檢定研究院；殼聚糖(浙江寧波華泰化工有限公司)；冰醋酸、甲醇、無水乙醇、磷酸為分析純；乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 以Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)為色譜柱。乙腈為流動相A，0.5%冰醋酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫，0～20 min，5%～15% A；20～60 min，15%～45%A[14]。檢測波長為281 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。樣品中各待測組分與其相鄰色譜峰的分離情況見圖1。

圖1 丹酚酸B和丹參飲樣品色譜圖(281 nm)

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品6.36 mg置于20 mL容量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，制成儲備液。據下述實驗要求，將對照品溶液稀釋，濃度為34.2 μg/mL。

2.3 供試品溶液的制備 丹參飲絮凝純化產物經濃縮干燥后得干浸膏。稱取丹參飲干浸膏約0.1 g置于50 mL容量瓶，加80%甲醇至刻度，稱定重量，超聲處理(功率140 W，頻率42 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 檢測波長的選擇 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜柱、流動相、柱溫、流速及進樣量，考察檢測波長281、254、366、306 nm時對各組分的吸收情況，見圖2。結果顯示，丹參飲供試品對不同檢測波長有較大的選擇，檢測波長281 nm下達到最大吸收，且吸收峰數多，分離良好，故選擇281 nm為檢測波長。

2.4.2 柱溫的選擇 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜柱、流動相、檢測波長、流速及進樣量考察在柱溫20、25、30、35、40 ℃條件下，樣品中各待測組分與其相鄰色譜峰的分離情況，見圖3。結果顯示，柱溫對分離度影響較小，故本實驗采用室溫25 ℃作為實驗溫度。

2.4.3 流速的選擇 按”2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜柱、流動相、檢測波長、進樣量及柱溫考察在流速0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min條件下，樣品中各待測組分與其相鄰色譜峰的分離情況，見圖4。結果顯示,流速0.8、0.9、1.0 mL/min時分離度最佳，但之間無顯著性差異，故采用柱流速為1.0 mL/min。

圖2 流速對色譜分離的影響

圖3 柱溫對色譜分離的影響

圖4 流速對色譜分離的影響

2.5 精密性試驗 按”2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件重復進樣6次。色譜圖中各色譜峰相對保留時間的RSD<0.66%，色譜峰相對峰面積的RSD<1.85%，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”，計算得色譜圖相似度>0.99(見圖5)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 按”2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件，于0、6、12、18、24 min進樣分析。由圖6可見，各主要色譜峰的相對保留時間的RSD<0.92%，相對峰面積的RSD均<2.13%，相似度>0.99，表明供試品溶液在24 h內穩定。

圖5 精密度試驗色譜圖

圖6 穩定性試驗色譜圖

2.7 重現性 按”2.3”項下方法分別制備6份供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件，得色譜圖中各色譜峰的相對保留時間的RSD<0.72%，相對峰面積的RSD<2.78%，相似度>0.99(圖7)，表明方法的重復性良好。

2.8 不同批次丹參飲水提液絮凝純化產物樣品的相似度比較

共有模式的建立：測定了18批丹參飲水提液絮凝純化產物樣品，經比較所有測定和記錄的色譜圖，從中選定了9個共有色譜峰，利用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”生成了18批樣品的指紋圖譜(見圖8)及共有模式(見圖1)，以8號峰丹酚酸B為參比峰(S)，計算18批丹參飲水提液絮凝純化產物指紋圖譜的相似度(表1)，以及各共有峰的相對保留時間及相對峰面積值(見表2、表3)。

圖7 重現性試驗色譜圖

圖8 18批丹參飲樣品指紋圖譜

樣品編號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18對照指紋圖譜S11．0001．000S21．0001．0001．000S31．0001．0001．0001．000S41．0001．0001．0001．0001．000S51．0001．0001．0001．0001．0001．000S61．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S71．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S81．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S91．0001．0000．9991．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S101．0001．0000．9991．0000．9991．0001．0001．0001．0001．0001．000S111．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S121．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S131．0001．0000．9991．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．0001．000S140．9990．9990．9980．9980．9980．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9991．0000．999S150．9980．9990．9980．9980．9980．9980．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9991．0001．0000．999S160．9980．9990．9980．9980．9980．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9991．0001．0001．0000．999S170．9980．9980．9970．9980．9980．9980．9980．9980．9980．9980．9980．9980．9980．9990．9990．9991．0000．998S180．9980．9990．9980．9980．9980．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9990．9991．0001．0001．0000．9991．0000．999

表2 丹參飲樣品指紋圖譜共有峰相對保留時間

表3 丹參飲樣品指紋圖譜共有峰相對峰面積

3 討論

根據共有峰相對保留時間和其他成分的相對峰面積的RSD值，以及18批指紋圖譜相似度均>99.0%，相似度較高，由此可知，樣品在化學成分組成和量上無明顯差異，指紋圖譜共性特征明顯。對比不同柱溫、不同流速、不同檢測波長色譜圖的異同，結果顯示，柱溫和流速對色譜峰數目無明顯差異。然而，對檢測波長281、254、366、306 nm進行比較，色譜峰在281 nm下達到最大吸收。

建立的指紋圖譜檢測方法操作簡便、專屬性強、重現性好，能夠體現丹參飲水提液絮凝純化產物的整體特征，有助于進一步科學評價和控制丹參飲相關制劑的質量。

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HPLC fingerprint spectrum analysis of flocculation of water-extraction solution from Danshen yin

PAN Mei-yun1,ZOU Yan-jun2,LI Fan-fan1,LIN Mian2,MA Shu-lei2*

(1.the First People′s Hospital of Wenling,Wenling 317500,China;2.Yongjia Hospital of TCM,Wenzhou 325401,China)

Objective To establish the HPLC fingerprint spectrum of flocculation of water-extraction solution from danshen yin.Methods HPLC method was used,the chromatographic column was Inertsil ODS-SP Extend C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm) by gradient elution of acetonitrile (A) and 0.5% acetic acid solution (B) as the procession of 0～20 min,5%～15% A,20～60 min,15%～45% A.The flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was 25 ℃.The detection wavelength was 281 nm.Results There were 9 common peaks of HPLC fingerprint spectrum of flocculation of water-extraction solution from danshen yin,and 8 peaks were identified as salvianolic acid B.The similarity of 18 samples were greater than 0.99.Conclusion The characteristics and specificity of HPLC fingerprint spectrum of flocculation of water-extraction solution from Danshen yin are significant,which can provide references for its quality control.

Danshen yin;Flocculation;Fingerprint spectrum

2016-04-09

1.溫嶺市第一人民醫院，浙江 溫嶺 317500;2.永嘉縣中醫醫院，浙江 溫州 325401

永嘉縣科技發展計劃項目(2015306)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612018

*通信作者