硼酸鈉活化p53誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡

魏 英，張有順，武 倫，袁方均，陳琴華，周文波*

硼酸鈉活化p53誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡

魏 英a，張有順b，武 倫b，袁方均b，陳琴華a，周文波b*

目的 觀察硼酸鈉(Borax)對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法 采用MTT法檢測(cè)不同濃度硼酸鈉對(duì)HepG2活力的影響，DAPI染色熒光顯微鏡及Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)硼酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)硼酸鈉對(duì)腫瘤抑制因子p53及其下游基因Bcl-2、Bax、Noxa、Puma mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果 與對(duì)照組比較，硼酸鈉各劑量組均能抑制HepG2的活力(P<0.01)；硼酸鈉誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，不同濃度硼酸鈉(0、1.0、2.0、4.0 mmol/L)處理24 h后，晚期凋亡細(xì)胞百分比從2.57%分別增加至8.13%、10.4%、15.24%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；硼酸鈉(4.0 mmol/L)分別作用6、12、24 h后，均可不同程度上調(diào)腫瘤抑制因子p53及促凋亡基因Bax、Noxa、Puma mRNA表達(dá)，抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 硼酸鈉抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)活性并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制與p53的活化及其下游Bax、Noxa、Puma基因表達(dá)上調(diào)，以及Bcl-2表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

硼酸鈉；人肝癌細(xì)胞株HepG2；凋亡；p53；Bcl-2

0 引言

肝細(xì)胞癌是全球常見(jiàn)的癌癥之一，每年有超過(guò)50萬(wàn)人被確診為肝細(xì)胞癌；其進(jìn)展快、死亡率高，僅2012年全球新增肝細(xì)胞癌病例782 500例，死亡745 500例，發(fā)病率和死亡率幾乎相等[1]。手術(shù)是肝細(xì)胞癌的首選治療方法，但大部分患者確診時(shí)已是肝癌晚期。晚期肝癌患者適合全身性治療，而化療是肝細(xì)胞癌全身治療的首選[2]。盡管肝細(xì)胞癌化療已取得巨大的進(jìn)展，其仍具有明顯的不良反應(yīng)，許多化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺傷正常細(xì)胞，導(dǎo)致顯著細(xì)胞毒性，患者5年生存率較低[3-4]，因此，開(kāi)發(fā)更多的可選擇性的有效抗肝細(xì)胞癌新型藥物勢(shì)在必行。

研究表明，硼對(duì)許多物種有益，在自然界中多以硼酸鈉(Borax)的形式存在[5]，生理濃度下硼無(wú)致突變致癌效應(yīng)，口服吸收較好。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為,硼是人體的一種必需營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)制與發(fā)展起著重要作用。近年來(lái),硼在腫瘤預(yù)防及治療方面越來(lái)越受重視，硼中子俘獲治療具有選擇性殺傷正常組織內(nèi)癌細(xì)胞的能力，已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤，并進(jìn)行了治療肝臟惡性腫瘤的嘗試[6]。文獻(xiàn)報(bào)道，硼通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善急性肝功能衰竭的肝臟病理學(xué)變化[7]；通過(guò)抑制增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)，降低硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞癌的發(fā)生率[8]，因此，硼對(duì)肝細(xì)胞癌的發(fā)生具有潛在的預(yù)防作用。目前有關(guān)硼抑制肝細(xì)胞癌的研究尚少，其涉及的機(jī)制較模糊，因此，深入探討硼對(duì)肝細(xì)胞癌作用及其機(jī)制的研究對(duì)發(fā)現(xiàn)新型的抗肝癌藥物意義重大。本實(shí)驗(yàn)觀察了硼酸鈉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)活性及誘導(dǎo)凋亡的影響，并初步探討了其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及試劑 人肝癌細(xì)胞株HepG2(武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心)；硼酸鈉(Sigma-Aldrich,221732)；RPMI-1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)；TRIzol Reagent(美國(guó)Incitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑(美國(guó)Fermentas公司)；MTT(Amresco)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(武漢安特捷生物技術(shù)有限公司)；PCR引物(上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成)。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)；CO2培養(yǎng)箱(法國(guó)Thermo公司)；Olympus IX71熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；熒光定量PCR儀Rotor Gene-6000(澳大利亞Rotor Gene公司)；BD FACS Caliber流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2，當(dāng)細(xì)胞覆蓋80%～90%瓶底后，用0.25%的胰酶-EDTA常規(guī)消化傳代，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)硼酸鈉對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 5×105個(gè)/mL的HepG2細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，周邊孔用無(wú)菌PBS填充，37 ℃、5% CO2孵育12 h。分別用濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L的硼酸鈉孵育，各組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。0、6、12、24、48、72 h后用PBS液洗滌換液，每孔加濃度為5 mg/mL的四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm吸光值(A490)，以0 mmol/L硼酸鈉處理組作為對(duì)照組，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。分析細(xì)胞存活率(Survival rate,SR)，A490可代表細(xì)胞的存活數(shù)。SR計(jì)算公式為：SR=A490各組測(cè)定值/A490對(duì)照組×100%。

1.2.3 DAPI染色熒光顯微鏡觀察硼酸鈉誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的情況 每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，12 h后用濃度為0、1.0、2.0、4.0 mmol的硼酸鈉作用24 h，PBS洗2次；4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次，5 min/次；DAPI染色15 min，PBS洗2次，熒光顯微鏡觀察照相。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將HepG2細(xì)胞懸液接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿，12 h后用濃度為0、1.0、2.0、4.0 mmol的硼酸鈉孵育24 h，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，收集1×106個(gè)細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 qRT-PCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá) 將1×105個(gè)/mL的HepG2細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔1 mL，0、4.0 mmol/L的硼酸鈉孵育6、12、24 h，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，應(yīng)用TRIzol Reagent總RNA抽提純化試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260與A280比值在1.8～2.0范圍。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在稀釋至7 ng/μL的cDNA中加入SYBR?GREEN PCR Master Mix和相應(yīng)基因擴(kuò)增引物(序列見(jiàn)表1)，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；60 ℃，20 s；72 ℃，1 min，40個(gè)循環(huán)。以目的基因域循環(huán)數(shù)(Threshold cycle，Ct)值對(duì)同一樣本的內(nèi)參照基因GAPDH Ct值進(jìn)行目的基因表達(dá)的相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)硼酸鈉對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響 與對(duì)照組相比，隨著硼酸鈉作用時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加，存活細(xì)胞數(shù)逐漸減少(P<0.05)。見(jiàn)圖1A、圖1B)。

表1 p53、Bcl-2、Bax、Noxa、Puma和GAPDH基因的正義、反義鏈引物序列

圖1 硼酸鈉對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響

2.2 硼酸鈉對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 硼酸鈉作用HepG2細(xì)胞24 h后，DAPI染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化。對(duì)照組細(xì)胞核大小一致，形態(tài)完整，染色質(zhì)分布均勻，呈淡藍(lán)色均染；硼酸鈉作用24 h后，細(xì)胞核大小不一，形態(tài)各異，染色質(zhì)濃縮，邊緣化，核膜破裂，染色質(zhì)破裂成塊狀，形成凋亡小體等典型凋亡狀態(tài)(圖2A)。Annexin V-FITC/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，左下象限(LL)顯示活細(xì)胞，右下象限(LR)顯示早期凋亡細(xì)胞，右上象限(UR)顯示晚期凋亡細(xì)胞，左上象限(UL)顯示死細(xì)胞。與對(duì)照組相比，不同濃度硼酸鈉作用HepG2細(xì)胞24 h后，晚期凋亡細(xì)胞的百分比逐漸增加(從2.57%增加至8.13%、10.4%、15.24%，P<0.05)。見(jiàn)圖2B、圖3。

2.3 硼酸鈉對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，硼酸鈉作用6、12、24 h后，腫瘤抑制因子p53和促凋亡基因Bax、Noxa、Puma mRNA表達(dá)均上調(diào)(P<0.01)；抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)降低(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

3 討論

盡管抗癌化療有新的進(jìn)展，但確切有效的化療藥物很少，因此，開(kāi)發(fā)低毒有效的化療藥物是目前研究的重點(diǎn)。硼是維持動(dòng)植物甚至是人類(lèi)正常生長(zhǎng)，完成生命周期的一種重要的營(yíng)養(yǎng)元素，健康成年男性血中硼的濃度為4.7～350 μmol/L[9]。此外，研究者還注意到，在藥物合成過(guò)程中,硼可以和其他原子(如：鐵)一樣提供分子修飾作用，以維持藥物空間構(gòu)象或藥效的穩(wěn)定性。近年來(lái)，基于硼的藥物開(kāi)發(fā)備受關(guān)注[10]。研究表明，硼能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)，含硼化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響包括多種酶促過(guò)程和抑制細(xì)胞分裂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]，而含硼化合物對(duì)肝癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制尚不清楚。本研究表明，硼酸鈉對(duì)HepG2細(xì)胞體外活性具有抑制作用，并誘導(dǎo)其凋亡，表明硼酸鈉可作為肝細(xì)胞癌治療的候選藥物。

圖2 硼酸鈉誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

圖3 Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

圖4 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)情況

目前，抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)主要集中在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用上[12-13]。本研究DAPI染色和Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果顯示，硼酸鈉能促使HepG2細(xì)胞染色質(zhì)邊集、濃縮，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

p53作為腫瘤抑制因子已經(jīng)被廣泛研究，其可以被DNA損傷、缺氧或異常的基因表達(dá)所激活，對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，受損嚴(yán)重的則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而避免癌變。p53的活化可上調(diào)促凋亡基因Bax、Noxa、Puma等的表達(dá)，抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)[14]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的主要成員，當(dāng)Bcl-2與Bax的比值降低時(shí)，線粒體透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，線粒體內(nèi)外膜間的細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等釋放，線粒體跨膜電位去極化，細(xì)胞發(fā)生不可逆性凋亡[15]。為闡述硼酸鈉誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了p53及下游相關(guān)基因的mRNA表達(dá)情況。本研究發(fā)現(xiàn)，硼酸鈉作用HepG2細(xì)胞6、12、24 h后,p53、Bax、Noxa、Puma基因表達(dá)顯著上調(diào)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)明顯下調(diào)。表明硼酸鈉通過(guò)活化p53，轉(zhuǎn)錄激活Bax等基因，抑制Bcl-2基因，從而啟動(dòng)線粒體依賴(lài)的凋亡途徑，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

總之，p53的活化及其調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄在硼酸鈉抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)活性、誘導(dǎo)凋亡中起重要作用。本課題為更好地了解硼酸鈉的抗肝癌作用提供了研究基礎(chǔ)，并且為硼酸鈉可以作為抗肝癌治療的候選藥物提供了理論依據(jù)。然而，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明硼酸鈉誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的其他分子機(jī)制。

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Apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell HepG2 induced by borax-activated p53

WEI Yinga,ZHANG You-shunb,WU Lunb,YUAN Fang-junb,CHEN Qin-huaa,ZHOU Wen-bob*

(a.Experiment Center,b.Department of Hepatobiliary Surgery,Dongfeng Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

Objective To observe the effect of borax on the growth inhibition and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2,and to explore its mechanism.Methods The potential effect of borax on the cell viability was examined using MTT assay.The cell apoptosis rate of cells treated with borax was analyzed by DAPI and Annexin V-FITC/PI staining.The level of tumor suppressor factor p53 and its downstream gene Bcl-2,Bax,Noxa,Puma mRNA were detected by real-time PCR.Results Compared with control group,borax in different dose group could inhibit the activity of HepG2(P<0.01).Borax induced apoptosis of HepG2 cells,and after 0,1.0,2.0,4.0 mmol/L borax treat 24 h,the percentage of late apoptotic cell increased from 2.57% to 8.13%,10.4% and 15.24% respectively(P<0.01),the difference being of statistical significance.After 4.0 mmol/L borax treatment for 6,12,24 h,the tumor inhibition factor p53 and pro-apoptotic gene Bax,noxa,puma mRNA expression significantly increased,but the anti-apoptosis gene Bcl-2 mRNA expression was significantly down-regulated(P<0.01).Conclusion Borax inhibits the growth of human hepatocellular carcinoma cell HepG2 activity and induces apoptosis.The mechanism may be related to the activation of p53,up-regulation of Bax,Noxa and Puma mRNA expression,and down-regulation of Bcl-2 mRNA expression.

Borax;Human hepatocellular carcinoma cell HepG2;Apoptosis;p53;Bcl-2

2016-05-13

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院a.實(shí)驗(yàn)中心，b.肝膽外科，湖北 十堰 442000

十堰市科技局基金(15Y56)；湖北省自然科學(xué)基金面上基金(2015CFB615)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612006

*通信作者