丹槐銀屑濃縮丸下調(diào)銀屑病模型豚鼠p21和p53基因的機制

張 霞，陳少秀，黃 萍，康曉晶，何華瓊

丹槐銀屑濃縮丸下調(diào)銀屑病模型豚鼠p21和p53基因的機制

張 霞1，陳少秀1，黃 萍1，康曉晶1，何華瓊2*

目的 建立豚鼠銀屑病模型，研究丹槐銀屑濃縮丸下調(diào)其p21和p53基因的機制。方法 將32只豚鼠隨機分為空白對照組、模型組、阿維A組和丹槐組，采用RT-PCR法檢測表皮脫落病變組織凋亡相關(guān)基因p21、p53和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等的表達。結(jié)果 丹槐組表皮脫落病變組織凋亡相關(guān)基因p53蛋白、p53-mRNA、p21蛋白及p21-mRNA表達均下調(diào)，與模型組和阿維A組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；VEGF蛋白和VEGF-mRNA表達下調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 丹槐銀屑濃縮丸在治療尋常型銀屑病時，可能通過下調(diào) p21和p53表達來降低表皮細胞凋亡率，并且與抑制VEGF過度表達、減少病變組織皮下血管新生、重建而減輕尋常型銀屑病的病理進程有關(guān)。

尋常型銀屑病；丹槐銀屑濃縮丸；p21；p53；血管內(nèi)皮生長因子

0 引言

尋常型銀屑病屬慢性炎癥性皮膚病，俗稱“牛皮癬”，具有易復(fù)發(fā)性、泛發(fā)性、頑固性的臨床特點[1]，銀屑病的病理改變以表皮細胞增殖過快和角化不全為主，其發(fā)病多與遺傳、自身免疫異常、內(nèi)分泌失調(diào)、炎癥反應(yīng)、精神或神經(jīng)因素有關(guān)[2]。研究表明，銀屑病病變表皮增生過度和角化不全與p21、p53高表達有明確的相關(guān)性[3]。基因檢測發(fā)現(xiàn)，脫落表皮的凋亡相關(guān)基因p21、p53高表達，且脫落表皮組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)也出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象[4]。推測通過下調(diào)基因p21、p53抑制VEGF高表達有可能成為治療銀屑病的新途徑。近年來，中草藥在臨床治療銀屑病有突出表現(xiàn)，但目前對中藥治療銀屑病的機制缺乏系統(tǒng)研究，多局限于中醫(yī)理論探討。本實驗以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗方法對中草藥丸劑丹槐銀屑濃縮丸在治療銀屑病方面進行了系統(tǒng)研究，觀察丹槐銀屑濃縮丸影響凋亡相關(guān)基因p53、p21和VEGF的表達，以期為臨床治療銀屑病提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 豚鼠32只，體重386～327 g，雌雄各半，用隨機數(shù)字表先編號，然后隨機分為4組：空白對照組、模型組、阿維A組和丹槐組，每組8只。實驗所用動物許可證號：SYXK(鄂)2011-0031，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 藥品及試劑 丹槐銀屑濃縮丸(黑龍江省中醫(yī)研究院醫(yī)院研制，批號：090801)；普萘洛爾片(江蘇常州亞邦制藥有限公司，批號：040512)；阿維A膠囊(重慶華邦制藥有限公司，批號：1420007670)；p21、p53、VEGF蛋白測試試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：028451、028455、028457)。RT-PCR檢測p21-mRNA、p53-mRNA和VEGF-mRNA試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：1601257、1601258、1601259)。

1.3 銀屑病造模方法 參照伍長娟等[5]方法，造模時動物雙耳剃毛，用配制成5%的普萘洛爾水溶液均勻涂于模型組、阿維A組和丹槐組動物雙側(cè)耳背處，以面積0.8～1.0 cm2、厚度1 mm為宜，1次/d，連續(xù)涂4周；空白對照組涂生理鹽水。造模成功標準：雙耳涂藥處出現(xiàn)銀屑病樣皮損樣改變或有脫落表皮組織，用打孔針取樣進行病理檢查發(fā)現(xiàn)表皮角質(zhì)層過度角化，釘突延長棘層變厚，真皮層出現(xiàn)中重度炎細胞浸潤，角質(zhì)層血管炎、內(nèi)有小膿腫等銀屑病性改變。結(jié)果顯示，模型組、阿維A組和丹槐組造模4周后均出現(xiàn)銀屑病樣皮損，成功率為100%。

1.4 治療方法 造模成功后，阿維A組用10%抗皮膚角化異常藥阿維A膠囊[10 mL/(kg·d)]灌胃給藥，丹槐組用配制成10%的丹槐銀屑濃縮丸灌胃[10 mL/(kg·d)]，空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，四組動物均連續(xù)治療4周。治療過程中觀察動物皮損部位病理改變，結(jié)束后取病變組織做病理學(xué)檢查。

1.5 檢測指標與方法 參照文獻[6]，于治療前后分別取各組兔銀屑病樣皮損部位組織，采用ELISA法檢測p53、p21和VEGF蛋白表達，GEL-Pro Analyzer軟件分析治療前后p53、p21和VEGF的mRNA表達。PCR引物設(shè)計：上游5′-GCTCACGCACTCGGTGCTCA-3′，下游5′-CCAGGCTCCAGAAGAAGTTG-3；用上述引物擴增兔DNA片段，再用SP-Max 3500FL型多功能熒光酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司，型號：3500FL)于450 nm波長下測定VEGF的OD值，對各組標本提取總RNA，設(shè)計20 μL體系以AMV逆轉(zhuǎn)錄酶先進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中獲得的cDNA模板1 μL、GAPDH為內(nèi)對照，再設(shè)計20 μL PCR擴增體系，在PCR儀中94 ℃預(yù)變性5 min后，按94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，擴增30個循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下拍照，記錄各條帶的吸收度。

2 結(jié)果

2.1 動物病理改變觀察 模型組、阿維A組、丹槐組在涂普萘洛爾造模4周后，表皮均出現(xiàn)明顯的皮損等病理學(xué)特征，如表皮脫落紅丘疹等類似于人類銀屑病樣改變。用打孔針取樣進行病理檢查證實發(fā)現(xiàn)，表皮角質(zhì)層過度角化，釘突延長棘層變厚，真皮層出現(xiàn)中重度炎細胞浸潤及角質(zhì)層血管炎、內(nèi)有小膿腫等銀屑病性改變，提示造模方法可行，造模成功。在治療4周后，空白對照組無病理改變，模型組所有癥狀加重。阿維A組皮損消失，表皮角化現(xiàn)象明顯減少，幾乎無炎細胞浸潤、表皮釘突及小膿腫消退。丹槐組與阿維A組類似，皮損面積減小，但病理檢查仍有部分動物表皮有角化現(xiàn)象，角質(zhì)層血管炎、小膿腫等較模型組及治療前明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 丹槐銀屑濃縮丸對豚鼠表皮脫落病變組織p53蛋白、p53-mRNA、p21蛋白、p21蛋白、p21-mRNA表達的影響 空白對照組豚鼠表皮脫落病變組織p53、p21蛋白有少量表達，治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組造模后表皮脫落病變組織p53蛋白、p53-mRNA、p21蛋白、p21-mRNA高表達，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；阿維A組治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療4周后，丹槐組與模型組、阿維A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 丹槐銀屑濃縮丸對實驗性銀屑病豚鼠表皮脫落病變組織VEGF蛋白表達的影響 空白對照組豚鼠表皮脫落病變組織VEGF蛋白有少量表達，治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組造模后VEGF蛋白和VEGF-mRNA高表達，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療4周后，阿維A組與治療前、模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療4周后，丹槐組與模型組、阿維A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 豚鼠表皮脫落病變組織p53、p21蛋白表達

注：*與空白對照組比較，P<0.05；#與治療前比較，P<0.05；△與模型組比較，P<0.05；▲與阿維A組比較，P<0.05

表2 豚鼠表皮脫落病變組織VEGF蛋白表達

注：*與空白對照組比較，P<0.05；#與治療前比較，P<0.05；△與模型組比較，P<0.05；▲與阿維A組比較，P<0.05

3 討論

既往研究表明，銀屑病發(fā)病多系外邪化熱入血造成機體過度反應(yīng)，血熱、血瘀、血燥病癥并存乃現(xiàn)風(fēng)熱濕之象[7]。該病治療有“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”的觀點，丹槐銀屑濃縮丸由丹參、槐花、柴草、赤芍、黃連、雞血藤地黃、白鮮皮、高青葉等諸藥調(diào)制成丸，具有清熱解毒、涼血活血、祛風(fēng)止癢之功效[8]。

銀屑病的發(fā)病機制目前尚無定論，研究表明，p53和p21是抑癌機制的關(guān)鍵基因之一，參與腫瘤進展、抑制細胞生長的生理進程，銀屑病時二者呈高表達[9]。p53、p21主要參與銀屑病角質(zhì)細胞增殖，二者高表達加劇過度角質(zhì)細胞增殖[10]。p21高表達抑制細胞周期依賴性激酶的活性，并可能直接抑制DNA復(fù)制和細胞凋亡，使皮損加重[11]。p53是p21的下游基因，與p21存在顯著正相關(guān)。兩者在病理組織中的表達改變程度均與細胞增生程度有關(guān)。本研究顯示，p53和p21在異常增生的表皮皮損組織中出現(xiàn)高表達。兩者可能有協(xié)同作用，調(diào)控局部細胞周期性凋亡，并相互促進，共同干擾正常細胞代謝并最終促使表皮皮損細胞增殖，加重銀屑病癥狀。本研究中阿維A組為陽性對照。阿維A為抗皮膚角化異常藥，是臨床治療銀屑病的主要藥物，其藥理作用主要是抑制T細胞增殖及表皮Ⅰ型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、促進角質(zhì)形成細胞分化，同時抑制角質(zhì)形成細胞增殖、皮脂過度分泌，減輕皮損處的炎性反應(yīng)，緩解皮損處的瘙癢及疼痛[12]。結(jié)果顯示，阿維A有治療作用，但其機制與下調(diào)p53、p21無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前(造模4周)，模型組、阿維A組和丹槐組p53、p21在表皮脫落病變組織中呈高表達，在空白對照組正常表皮中幾乎不表達。表明p53、p21含量與細胞異常增生程度有關(guān)，也與病變細胞的異常增殖及因此而導(dǎo)致的功能紊亂和病程密切相關(guān)，與以往研究相符[13]。治療4周后，丹槐組表皮脫落病變組織凋亡相關(guān)基因p53蛋白、p53-mRNA、p21蛋白、p21-mRNA表達均下調(diào)，與模型組和阿維A組有顯著差異。提示丹槐銀屑濃縮丸通過下調(diào)患者p53、p21，最終降低細胞異常增生，提高角質(zhì)細胞凋亡率，使皮損恢復(fù)正常外觀。此外，丹槐組VEGF蛋白和VEGF-mRNA表達下調(diào)，與模型組比較有顯著差異。除空白對照組外，治療前(造模4周)，其他三組VEGF及VEGF-mRNA在表皮脫落病變組織中高表達。VEGF是一種高度特異性的促血管生長因子，有學(xué)者認為，銀屑病是由自分泌型 VEGF增多造成的[14]，此觀點在本研究模型組中得以驗證，模型組治療前后VEGF及VEGF-mRNA在表皮脫落病變組織中均出現(xiàn)高表達，且治療前后有顯著差異。提示銀屑病的發(fā)病機制與表皮及真皮下VEGF、VEGF-mRNA上調(diào)有關(guān)，VEGF可能通過刺激真皮乳頭微血管的異常增生進而加重銀屑病發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致嚴重皮損，與朱凡等[15]研究結(jié)果一致。在正常情況下，機體VEGF、VEGF-mRNA有少量表達；當(dāng)機體抵抗力下降、免疫異常、炎癥刺激，尤其在出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)時，可能破壞VEGF及VEGF-mRNA而使其過度表達[16]。治療4周后，丹槐組VEGF蛋白、VEGF-mRNA表達下調(diào)，提示丹槐銀屑濃縮丸也有降低VEGF蛋白和VEGF-mRNA的作用，可減少病變組織皮下血管新生、重建，進而減輕尋常型銀屑病的病理進程。

總之，p53、p21高表達與尋常型銀屑病的病理改變和病理進程確有相關(guān)性，特別是p53在尋常型銀屑病皮損中高表達是造成皮損的關(guān)鍵，其在病理組織中的表達改變程度均與細胞增生的程度呈正相關(guān)[9]。丹槐銀屑濃縮丸通過涼血活血、清熱解毒、祛風(fēng)止癢而發(fā)揮治療銀屑病的功效，可能與其下調(diào)p21、p53表達而降低表皮細胞凋亡率，抑制VEGF過度表達，減少病變組織皮下血管新生、重建，進而減輕病理進程有關(guān)。

[1] 侯艷霞,蔣靖.紫外線照射及光動力療法治療銀屑病的研究進展[J].沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,16(3):173-175.

[2] 趙辯.臨床皮膚病學(xué)[M].第3版.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,2001:759-762.

[3] 徐世正,王宏偉,王秀麗,等.p21與p53蛋白在銀屑病皮損中的表達[J].中華皮膚科雜志,1998,31(2):105-106.

[4] 王學(xué)軍,胡二為,陶以成,等.丹槐銀屑濃縮丸對豚鼠銀屑病樣模型組織VEGF、VEGFR含量的影響[J] .中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2011,10(2):96-97.

[5] 伍長娟,沈士詩.鹽酸普萘洛爾造模周期對豚鼠銀屑病模型的影響[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015,32(5):374-375.

[6] 龍劍文,皮先明,涂亞庭,等.進行期尋常性銀屑病皮損β-連環(huán)蛋白、VEGF和VEGFR-2的mRNA表達[J] .中國皮膚性病學(xué)雜志,2015,29(1):29-31.

[7] 樊敏,宋憲.低劑量維A酸聯(lián)合消銀膚樂飲治療銀屑病150例[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2003,23(10):784-785.

[8] 王學(xué)軍,陶以成,劉長發(fā),等.丹槐銀屑濃縮丸對低鼠銀屑病模型的病理實驗研究[J].中國中醫(yī)急癥,2010,19(1):104-106.

[9] 賀琪,岳青,皮先明,等.p33ING1B和p53在銀屑病和基底細胞癌中的表達及臨床意義[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(9):1391-1394.

[10]尤德塑,柏冰雪,馬烈,等.銀屑病患者皮損中Bcl-2、Bax及p21的表達[J].中華皮膚病雜志,2000,33(6):412-413.

[11]劉旭星.阿維A聯(lián)合窄譜中波紫外線治療65例中重度尋常型銀屑病療效觀察[J].中國藥物與臨床,2012,12(6):786-787.

[12]Yazici AC,Karabulut AA,Ozen O,et al.Expression of p53 in lesions and unaffected skin of patients with plaque-type and guttate psoriasis:a quantitative comparative study[J].J Dermatol,2007,34(6):367-374.

[13]陳艷,席建元,李小朋,等.阿維A治療尋常型銀屑病的療效觀察及對外周血VEGF表達的影響[J].現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué),2012,24(12):1395-1397.

[14]朱凡,鄭敏,鮑彰,等.銀屑病患者皮損中血管內(nèi)皮生長因子受體的表達與血管增生的關(guān)系[J].中華皮膚科雜志,2003,36(7):365-367.

[15]李文彬,閆小寧,田慶,等.半枝蓮方對尋常型銀屑病血熱證患者血清TNF-a及VEGF的影響[J].陜西中醫(yī),2014,35(9):1213-1214.

Mechanism of Danhuaiyinxie concentrated pill in down-regulating p21 and p53 gene of psoriasis guinea pig model

ZHANG Xia1,CHEN Shao-xiu1,HUANG Ping1,KANG Xiao-jing1,HE Hua-qiong2*

(1.Affiliated Hospital of Hubei Medical College,Shiyan Taihe Hospital,Shiyan 442000,China;2.Function Laboratory of Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

Objective To establish a guinea pig model of psoriasis and research the mechanism of Danhuaiyinxie concentrated pill in down-regulating p21 and p53 gene.Methods Totally 32 guinea pigs were randomly divided into blank control group,model group,Avia group and Danhuai group,and the epidermal-shedding-lesions-apoptosis-related genes (p53 and p21) and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected by RT-PCR.Results The expression of epidermal-shedding-lesions-apoptosis-related gene p53 protein,p53-mRNA,p21 protein and p21-mRNA in Danhuai group was down-regulated compared with model group or Avia group (P<0.05);the expression of VEGF protein and VEGF-mRNA was down-regulated compared with model group (P<0.05).Conclusion Danhuaiyinxie concentrated pill can down-regulate the expression of p21 and p53 to decrease the apoptosis rate of epidermal cells in the treatment of psoriasis vulgaris,and inhibit the over-expression of VEGF,reduce the angiogenesis and reconstruction of lesion tissue to alleviate the pathological process of psoriasis vulgaris.

Psoriasis vulgaris;Danhuaiyinxie concentrated pill;p21;p53;Vascular endothelial growth factor

2016-05-30

1.湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)皮膚科，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院機能實驗室，湖北 十堰 442000

湖北省教育廳重點項目(D20122402)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612004

*通信作者