二甲雙胍對NAFLD大鼠肝臟脂聯素/SIRT1 mRNA表達的影響

申 甜，雷 濤，徐碧林，陳 琳，章志建

二甲雙胍對NAFLD大鼠肝臟脂聯素/SIRT1 mRNA表達的影響

申 甜，雷 濤*，徐碧林，陳 琳，章志建

目的 觀察二甲雙胍對高脂飲食誘導NAFLD大鼠肝臟脂聯素和SIRT1基因表達的影響，探討其潛在的機制。方法 將34只SD大鼠隨機分為2組：對照組(NC組，12只，給予普通飼料)、高脂組(HF組，22只，給予高脂飲食)，喂養8周后兩組各隨機抽取6只；證實NAFLD模型建立后，將剩余HF組大鼠隨機分為二甲雙胍干預組(HF+M組，8只)、高脂組(HF1組，8只)及對照組(NC1組，6只),均給予等體積生理鹽水，灌胃8周后,測定空腹血糖(FBG)、血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、游離脂肪酸(FFA)及肝臟TG含量，測定胰島素(FINS)水平，并計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)；HE染色觀察肝臟病理形態學變化；采用Real-time PCR法檢測肝組織脂聯素、SIRT1、AMPK-α mRNA表達。結果 高脂喂養8周后,HF組大鼠NAFLD模型建立，伴明顯胰島素抵抗。HF+M組大鼠血清TC、TG、FFA、FBG、ALT、AST、肝臟TG含量及HOMA-IR低于HF1組(P<0.05)，血清脂聯素較HF1組升高(P<0.05)，肝臟脂肪變較HF1組有所改善；與HF1組比較，HF+M組肝臟SIRT1、AMPK-α mRNA表達增加(P<0.05)。結論 二甲雙胍可減輕NAFLD大鼠胰島素抵抗及肝臟TG沉積，其機制可能與通過升高血清脂聯素水平，進而激活SIRT1/AMPK信號通路有關。

二甲雙胍；非酒精性脂肪肝病；脂聯素；SIRT1

0 引言

非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)在全球多個地區的發病率逐年增加，其在肥胖人群中的發病率為58%～74%[1]。NAFLD與肥胖、血脂升高、胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)和隨之而來的糖耐量異常及2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)[2]密切相關。脂肪因子(瘦素、抵抗素)和炎性因子相互作用可導致IR，促進脂肪肝炎性改變及肝臟糖脂代謝紊亂加重；而脂聯素(Adiponectin)是由脂肪組織分泌的唯一起保護作用的脂肪細胞因子，具有抗炎、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化的作用。沉默調節蛋白1(SIRT1)是在哺乳動物細胞中的一種蛋白去乙酰化酶，具有改善外周胰島素抵抗、促進脂類物質被動員的作用[3]。SIRT1可使脂肪細胞的叉頭轉錄因子O1(FOX1)發生去乙酰化，進而上調脂聯素的轉錄水平[4]，但在NAFLD發病中的作用尚未完全明確。本研究利用高脂飲食喂養大鼠復制NAFLD模型[5]，觀察脂聯素、SIRT1在NAFLD發病機制中的作用及二甲雙胍干預對NAFLD的療效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 健康清潔級5～6周齡雄性SD大鼠34只，體重185～200 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，由上海市普陀區中心醫院動物飼養中心分籠喂養。正常對照組給予普通飼料(上海市普陀區中心醫院動物飼養中心提供)喂養，高脂飼料(78%基礎飼料+15%豬油+5%蔗糖+1.8%膽固醇+0.2%膽鹽)由上海斯萊克實驗動物有限公司定制生產。鹽酸二甲雙胍片(500 mg/片，購于上海施貴寶制藥公司)。胰島素(FINS)、脂聯素、游離脂肪酸(FFA)及三酰甘油(TG)試劑盒均購于上海鈺森生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit(TAKARA公司)，SYBR premix EX TaqTMII(TAKARA公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組 所有SD大鼠先用普通飼料適應性喂養1周后，按隨機數字法分為對照組(NC組，12只)和模型組(HF組，22只)。喂養8周后，兩組隨機抽取6只，進行稱重(體重及肝重，并計算肝指數)及血脂、胰島素等生化指標檢測，比較各組之間肝組織病理學變化，鑒定HF組NAFLD造模成功。將剩余模型組大鼠隨機分為二甲雙胍干預組(HF+M組，8只，高脂喂養+二甲雙胍500 mg/(kg·d)]，高脂組(HF1組，8只)及剩余對照組(NC1組6只)均給予等體積生理鹽水，連續灌胃8周。

1.2.2 標本采集及檢測 連續灌胃8周后，取材前禁食12 h(不禁水)，稱重，用乙醚腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心，分離血清存于超低溫冰箱備用；使用全自動生化分析儀檢測ALT、AST、TC、TG、FBG；分別按照脂聯素、胰島素ELISA試劑盒說明要求測定大鼠血清脂聯素、FINS，根據FBG、FINS計算胰島素抵抗指數IRI=(FINS×FBG)/22.5。迅速取出各樣本肝右葉，大小為2.5 cm×2.5 cm×0.5 cm，甲醛溶液固定，包埋，制備石蠟切片，行HE染色，做肝組織病理學觀察；其余肝臟-70 ℃凍存。

1.2.3 氯仿∶甲醇(2∶1)制備肝臟勻漿，應用TG測定試劑盒檢測肝臟TG水平。

1.3 實時定量PCR檢測 取各樣本肝組織30 mg，TRIzol抽提大鼠肝臟總RNA，按SuperscriptⅢ逆轉錄酶試劑盒說明逆轉錄得到cDNA。引物設計與合成：基因序列均從GenBank中獲取，引物由南京生工合成：adiponectin：5′-GTCTCCGTGCTTCCGATGAA-3′，5′-GGTCAAACTGGACTTGGGGT-3′；SIRT1：5′-GATGATGCTGACAGACCGGA-3′，5′-AGTTCCCAATGCTGGTGGAG-3′；AMPK-α:5′-GAGCCCTGAACTTGCTTTTACA-3′，5′-TGTCCGTTCTATGCGCTGG-3′；GAPDH：5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。擴增條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。根據TRIzol方法提取大鼠肝臟總RNA，按SuperscriptⅢ逆轉錄酶試劑盒說明逆轉錄得到cDNA。使用熒光定量PCR儀(羅氏96lightcycler)進行目標基因的實時熒光定量 PCR檢測。PCR檢測條件為:95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s,60 ℃ 45 s，40 個循環。擴增完成后，應用反應產物的溶解曲線檢測其均一性，每個反應重復 3 次。反應結束后，對所有樣品進行規一化處理，使用2-ΔΔCt方法計算樣本目的基因相對表達量，以GAPDH作為內參基因。

2 結果

2.1 生化指標等比較 二甲雙胍干預后，各組生化指標、FFA測定及胰島素抵抗指數比較見表1。

2.2 肝組織病理HE染色 灌胃8周后，HF1組出現明顯脂肪變性，且胞漿呈大面積空泡化，被大量小泡性脂滴所占據，大部分細胞核被擠向細胞邊緣，肝竇不清晰，肝索排列紊亂，肝小葉內及匯管區可見大量以單核、淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤及點狀壞死;HF+M組肝小葉結構仍有紊亂,肝細胞腫脹程度、胞漿疏松化較HF1組略有減輕，脂肪泡數目減少，脂滴縮小。見圖1。

表1 二甲雙胍對NAFLD大鼠生化指標、FFA及脂聯素的影響

注：*與NC1組比較，P<0.05；#與HF1組比較，P<0.05

圖1 肝組織HE染色(×100)

2.3 各組肝臟Adiponectin、SIRT1 mRNA、AMPK-α mRNA表達 與NC1組比較，HF1組肝臟SIRT1、AMPK-α、adiponectin mRNA表達均降低；二甲雙胍干預后,肝臟SIRT1、AMPK-α mRNA表達增加(P<0.05)，而adiponectin mRNA表達無顯著變化(P>0.05)。見表2。

表2 干預后各組大鼠肝臟Adiponectin、SIRT1 mRNA、AMPK-α mRNA表達比較

注：*與NC1組比較，P<0.05；#與HF1組比較，P<0.05

3 討論

NAFLD是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝臟損害。經典NAFLD“二次打擊學說”認為，外周胰島素抵抗通過減弱胰島素抑制脂肪分解的作用，使大量游離脂肪酸從脂肪組織分解釋放而增加肝臟的脂肪酸攝入，導致TG在肝細胞內過度合成，形成肝臟脂肪變性，即“第一次打擊”；各種炎癥因子、脂肪因子紊亂增加了細胞內的氧化應激及線粒體功能障礙，可最終加重肝臟的炎癥及纖維化，即“第二次打擊”。由脂肪組織分泌的促炎和抗炎脂肪因子間的平衡失調有助于NAFLD 的發生、發展。脂聯素是由脂肪細胞特異性分泌，具有2種受體：AdipoRl和AdipoR2。AdipoRl分布廣泛，而AdipoR2主要表達于肝臟，具有改善外周組織胰島素抵抗、降低葡萄糖和促進脂質分解的功能[6]。

本研究顯示，在高脂飲食喂養8周后，模型組大鼠出現多飲、多尿、多食，體重及血糖升高，血清TC、TG及FFAs水平較對照組明顯升高，脂聯素水平下降。肝臟組織學顯示，混和組肝臟出現明顯的脂肪變性，胞漿空泡化，被大量小泡性脂滴所占據，證實高脂誘導NAFLD造模成功。作為糖尿病一線用藥，二甲雙胍具有降糖、降脂及改善胰島素抵抗的作用，同時，部分動物實驗也證實，其可以改善NAFLD肝臟脂肪形態學變化，根據NAFLD最新診療指南[7]，推薦二甲雙胍用于NAFLD的治療，但有關的機制尚不完全清楚。二甲雙胍可通過降低血漿葡萄糖水平而間接下調胰島素及胰島素生長因子-1水平[8-10]，還可通過激活AMPK活性，阻止肝臟葡萄糖的釋放、促進骨骼肌葡萄糖的攝取而改善胰島素抵抗[11-12]。此外，二甲雙胍通過抑制AMPK活性的相關基因(ACC1、ACC2和HMG-CoA[9,13-14]，而減少游離脂肪酸的脂質合成，進而改善胰島素抵抗。本研究中，模型組大鼠經二甲雙胍灌胃后，血糖、血脂、肝酶指標及胰島素、脂聯素水平均明顯改善，肝臟脂肪變程度部分逆轉，推測二甲雙胍可能通過提高脂聯素水平而部分改善肝臟IR。

SIRT 是在哺乳動物細胞中發現的一種尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的蛋白去乙酰化酶，通過使多種蛋白質的賴氨酸殘基發生去乙酰化而發揮細胞代謝調節(如能量代謝、糖脂代謝等)、改善氧化應激及線粒體功能障礙和減輕炎癥反應等發揮改善NAFLD肝臟病變的作用。應用轉基因技術增加SIRT1表達，明顯提高大鼠血清脂聯素水平和肝組織AdipoR2的表達，減輕高脂飲食誘發的肝細胞脂肪變性[9]。脂聯素可增加肌管細胞和枯否細胞的SIRT1蛋白表達，基因敲除AdipoR1和AdipoR2可完全阻斷上述調節作用，提示脂聯素直接上游調節SIRT1。AMPK為“細胞能量調節器”，在培養的肝細胞和動物模型中發現SIRT1通過調節AMPK的上游激酶-肝激酶B1直接磷酸化AMPK亞單位的172位蘇氨酸激活AMPK。

有研究顯示，在高熱量飲食誘導的大鼠NAFLD模型中，肝臟SIRT1的表達量顯著下降，而在飲食熱量限制后，肝臟的SIRT1表達量顯著升高，并且肝臟病變得到明顯改善[10-11]，而全身SIRT1敲除和肝臟特異性SIRT1敲除的小鼠則出現嚴重的肝臟脂肪變性，甚至炎癥反應[13-16]。本試驗發現，模型組SIRT1水平較對照組下降，二甲雙胍干預后，其水平可升高。推斷SIRT1可作為NAFLD病理生理過程中的關鍵調節靶點，通過下游多種機制而發揮改善NAFLD肝臟病變的作用。在對高脂喂養誘導小鼠進行肝SIRT1基因敲除后，小鼠則會出現明顯的肝脂肪變、炎癥改變及內質網應激反應[17]，由此證實SIRT1具有胰島素抵抗、胰島素敏感性、改善氧化應激的調節功能。

本研究采用RT-PCR發現,模型組大鼠肝臟中AMPK-α、脂聯素、SIRT1 mRNA表達低于對照組，這可能是攝入高熱量抑制了SIRT1的表達，是機體的代償反應。在使用二甲雙胍后，高脂組肝臟AMPK-α及SIRT1 mRNA表達水平較高脂組升高，脂聯素mRNA表達有增加趨勢。

綜上所述，高脂喂養大鼠可導致肝組織脂肪變，伴隨血清中脂聯素水平降低，肝組織SIRT1、adiponectin、AMPK-α mRNA表達下降及肝臟TG堆積。二甲雙胍可明顯升高血清脂聯素水平，可能通過調節肝臟Adip-SIRT1-AMPK信號通路導致脂質合成的關鍵酶ACC和SREBP的表達下調，繼而改善脂質沉積，這可能是防治NAFLD發生的重要機制之一，具體的機制有待進一步研究。

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Effect of metformin on mRNA expression of adiponectin and SIRT1 in liver tissue of NAFLD rats

SHEN Tian,LEI Tao*,XU Bi-lin,CHEN Lin,ZHANG Zhi-jian

(Shanghai Putuo District Center Hospital,Shanghai 200062,China)

Objective To observe the effect of metformin on mRNA expression of liver adiponectin and SIRT1 in NAFLD rats induced by high-fat diet,and discuss the possible mechanisms.Methods Totally 34 SD rats were randomly divided into two groups:normal control group (NC group,n=12,normal diet) and high fat group (HF group,n=22,high fat diet).Six rats were randomly selected from two groups respectively after being fed for 8 weeks to confirm that the NAFLD model had been established.The other NAFLD rats in HF group were divided into metformin treatment group (HF+M group,n=8) and HF1 group (n=8).Rats in HF+M group and NC1 group were respectively given intragastric administration of metformin 500 mg/(kg·d) and equal volume of saline for 8 weeks.The levels of serum alanine transferase (ALT),aspartate aminotransferase (AST),total cholesterol (TC),total glyceride (TG) and free fatty acid (FFA) were detected after 8 weeks of gavage,the fasting serum glucose and insulin (FINS) level were measured and the insulin resistance index (HOMA-IR) were calculated.The liver pathological changes were observed by HE staining,and the adiponectin,SIRT1 and AMPK-α mRNA were measured by using real time PCR.Results After 8 weeks of high-fat diet,the NAFLD rat model of HF group which was complicated with insulin resistance was established.Compared with HF1 group,the levels of serum TC,TG,FFA,FBG,ALT and AST,the liver TG content and HOMA-IR in HF+M group were lower (P<0.05),while the level of adiponectin was higher (P<0.05),and the pathological changes of rats′ liver were improved.The expression of SIRT1,adiponectin and AMPK-α mRNA in the liver in HF+M group was higher than that of HF1 group (P>0.05).Conclusion Metformin can alleviate the insulin resistance and the liver TG deposition of NAFLD rats induced by high-fat diet,the mechanism may be associated with the activation of SIRT1/AMPK signal pathway through up-grading the serum adiponectin level.

Metformin;Nonachoholic fatty liver disease (NAFLD);Adiponectin;SIRT1

2016-05-22

上海市普陀區中心醫院，上海 200062

上海市衛生局青年科研項目(2013Y079)；上海市中醫藥大學后備業務專家培養計劃，上海市普陀區臨床重點專科-內分泌科項目(2016PTZK05)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612003

*通信作者