維生素D對急性白血病多重耐藥細胞的逆轉耐藥機制探討①

樊 婷

(湖北省隨州市中心醫院，湖北 隨州 441300)

?

維生素D對急性白血病多重耐藥細胞的逆轉耐藥機制探討①

樊 婷

(湖北省隨州市中心醫院，湖北 隨州 441300)

目的：探討維生素D對急性白血病多重耐藥細胞的逆轉耐藥機制。方法:以MTT法獲取無毒濃度維生素D，開展濃度依賴實驗；經流式細胞儀監測細胞內柔紅霉素以及P-糖蛋白(P-gp)表達水平；以實時熒光定量PCR(Real～time PCR)測定細胞內mdrl及mdpl mRNA表達變化；以生化法測定細胞內谷胱甘肽(GSH)水平。結果:維生素D可使耐藥細胞耐藥倍數下降，且有劑量依賴；維生素D干預Jurcat/ADR48h后，促使細胞內化療藥物濃度上升，抑制P-gP以及mdrl、mrpl基因的表達；維生素D使Jurcat與Jurcat/ADR細胞內GSH的水平顯著降低。結論:維生素D對于Jurcat/ADR耐藥逆轉顯著。維生素D參與抑制細胞表面的P-gp表達水平，抑制mdrl、mrpl mRNA表達及使細胞內GSH水平降低，間接提高細胞內的化療藥物濃度，實現對白血病的有效治療。

維生素D； 白血病； 多重耐藥

在目前白血病臨床治療中，聯合化療是最常見的治療方案，能使白血病患者的生存期得以延長。然而，化療過程中出現原發耐藥患者約占15%～30%，經化療后完全緩解的患者繼發耐藥約占60%～80%[1]，嚴重者甚至導致死亡。多重耐藥(MDR)成為急性白血病化療失敗導致復發的首要原因[2]。傳統化療藥干預MDR腫瘤細胞的臨床效果不顯著，導致化療失敗，急性白血病治療也是如此[3]。本研究以維生素D對急性白血病細胞株進行耐藥逆轉研究，現總結如下。

1 材料與方法

1．1 材 料

1．1．1 細胞株及其培養:建立人急性T淋巴細胞白血病(ALL)耐藥細胞株Jurcat/ADR。購自上海拜力生物科技有限公司的普通Jurcat細胞株。Jurcat/ADR細胞培養體系根據上海拜力生物科技有限公司的培養指標加入終質量濃度為0．5mg/L的多柔比星(doxorubicin，ADM)，進行為期2周的無藥培養。

1．1．2 試劑:維生素D(上海撫生生物科技有限公司，批號：V9325，1g)；歐洲胎牛血清；注射用鹽酸柔紅霉素；RPMI 1640；鼠抗人P-gP單克隆抗體；cDNA第一鏈合成試劑盒、RNA提取試劑盒；GSH試劑盒；引物包括：mdrl上游引物5’-CCCAT-CATTGCAATAGCAGG-3’，下游引物為5’-GTFCAAACTTCTGCTCCTCA-3’，片段長157bp；mrpl上游引物為5’-GGACCTGGACTTCGTTCTCA-3’，rmpl下游引物5’-CGTC-CAGACTTCTTCATCCG-3’，片段長292bp。

1．2 方法:濃度依賴實驗在采用MTT法篩選維生素D的無毒劑量，其抑制率不應大于10%的前提下，分為以下組：實驗組：化療藥物柔紅霉素(daunorubicin，DNR)、多柔比星(DOX)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside，Arac )、長春新堿(vincristine，VCR)聯合維生素D，每個樣本加注10ul維生素D維持其質量濃度分別達到10-3mg/L(A)、10-4mg/L(B)、10-5mg/L(C)、10-6mg/L (D)4個組。每組每孔均加入5ulADR(DNR、DOX、Arac、VCR)，保證其終質量濃度達到50ul/L。對照組：單純化療藥物組(DNR、DOX、Arac、VCR)：細胞懸浮液加注75uL化療藥物。Jurcat及Jurcat/ADR加入10-3mg/L(A-s)、10-4mg/L(B-s)、10-5mg/L(C-s)、10-6mg/L(D-s)滴度的Vit D作為基線，對維生素D聯合化療藥物對Jurcat及Jurcat/ADR的耐藥狀況進行參照。采用Real-time PCR檢測mdrl mRNA、mrpl mRNA的表達情況，計算其相對表達量，每個實驗設3個平行，結果取平均值。蛋白分析法檢測GSH，計算各組細胞GSH含量，每個實驗設3個平行，結果取平均值。

2 結 果

2．1 維生素D的耐藥逆轉及濃度依賴實驗:伴隨Vit D質量濃度的遞增，Jurcat/ADR耐藥倍數降低，推測維生素D逆轉了Jurcat/ADR對DNR、DOX、Arac、VCR的耐藥性(P<0．05)，維生素D對逆轉多柔比星的耐藥效應最為顯著，逆轉柔紅霉素的耐藥效應顯著，但不及多柔比星。見表1。

表1 維生素D聯合DNR、DOX、Arac、VCR48h后Jurcat及Jurcat/ADR的耐藥逆轉狀況

2．2 Vit D對Jurcat/ADR內mdrl，mrpl mRNA表達的影響:無毒不同滴度Vit D作用JurcaL/ADR細胞株48h后，經Real-time PCR儀擴增，實驗結果提示，實驗組mdrl、mrpl mRNA表達顯著低于對照組，且隨Vit D質量濃度遞增，mdrl、mrpl mRNA表達隨之降低，呈現出劑量依賴性。見表2。

表2 Vit D對Jurcat/ADR內mdrl，mrpl mRNA表達的影響

注:A-r代表A-DNR，A-DOX，A-Arac，A-VCR的平均值，B-r、C-r、D-r以此類推。體現不同滴度Vit D對Jurcat/ADR內mdrl，mrpl mRNA表達的影響。我們可通過表2看到，Vit D濃度越高，抑制Jurcat/ADR內mdrl，mrpl mRNA表達作用越明顯。

2.3 Vit D對Jurcat、Jurcat/ADR細胞內GSH水平的影響:Jurcat/ADR細胞株處于不同滴度Vit D中，隨Vit D滴度遞增能使Jurcat/ADR內GSH水平受到顯著影響，抑制GSH藥物外排泵可能促進了逆轉Jurcat/ADR細胞的耐藥性，見表3。

表3 Vit D對Jurcat、Jurcat/ADR細胞內GSH影響

3 討 論

兒童白血病中90%以上為急性白血病，慢性白血病僅占3%～5%.主要是慢性粒細胞白血病[4]。兒童白血病在任何年齡均可發病，但以學齡前期和學齡期兒童多見；男性發病率高于女性。聯合化療緩解了兒童ALL，然而，介于MDR腫瘤細胞的影響，大部分傳統化療藥物無法對MDR腫瘤細胞起到治療作用，導致白血病復發，因此尋找安全有效的耐藥逆轉劑極具臨床意義。

臨床報告顯示，長時間維生素 D的缺乏可導致個體患肺癌、胰腺癌和皮膚癌等多種癌癥，或出現精神抑郁、心血管疾病、糖尿病等癥狀。研究結果顯示ATRA與維生素D這2種藥物在化療過程中能有效增加MDR腫瘤細胞敏感性，同時減輕患者化療后不良反應的發生幾率。然而維生素D對于急性白血病耐藥細胞株是否存在耐藥逆轉仍需實驗驗證。

本研究認為維生素D對多柔比星、阿糖胞苷、柔紅霉素、長春新堿等不同化療藥物作用下的Jurcat/ADR存在耐藥逆轉效應，且對逆轉多柔比星的耐藥效應最強，對逆轉環磷酰胺的效應較差。維生素D的水平越高逆轉效應越強，體現了明顯的藥物濃度依賴性。耐藥基因mRNA表達實驗提示Jurcat/ADR細胞株中無明顯變化，在Jurcat/ADR細胞株中mrpl mRNA的表達隨著維生素D質量濃度的增加而減低。維生素D對Jurcat/ADR細胞表面P-gP水平的影響實驗發現隨著維生素D質量濃度的增加可降低。本實驗發現隨著維生素D質量濃度的增加可影響Jurcat/ADR細胞內的GSH水平，也存在藥物濃度依賴性，推測逆轉Jurcat/ADR細胞的耐藥性可能是通過抑制GSH藥物外排泵發揮作用。 綜上所述，無毒劑量的維生素D與Jurcat/ADR細胞作用后可降低細胞mdrl及mrpl mRNA的表達，同時降低P-gp及GSH的表達量，可推測維生素D具備逆轉MDR的作用，其機制可能是抑制細胞mdrl、mrpl耐藥基因的表達和降低細胞表面P～gp及細胞內GSH含量有關，進而增加細胞內的藥物濃度，提高化療藥物殺滅腫瘤細胞的作用。

[1] 張燕,張霞,魏超,等.急性白血病化療患者抑郁狀況調查分析[J].國際精神病學雜志,2015，18(3):77～79.

[2] 盧菲.急性髓性白血病耐藥相關miRNA分子功能及作用機制研究[D].山東大學,2014.

[3] 白曉玲,姚慧,趙洪寧,等.急性淋巴細胞性白血病患兒WT1基因與腫瘤耐藥基因表達的關系[J].中華兒科雜志,2002,40(10):589～592.

[4] 鄧開琴.維生素D缺乏與兒童疾病研究進展[J].醫學綜述,2015,21(23):4302～4304.

① 【基金項目】湖北省科技廳基金項目，(編號：BK2008254)

1006-6233(2016)12-2050-03

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.12.047