牛致病性大腸桿菌菌影的制備

王士霞，常春龍，翟軍軍，倪宏波

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163319）

牛致病性大腸桿菌菌影的制備

王士霞，常春龍，翟軍軍，倪宏波*

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163319）

制備牛源大腸桿菌菌影，為其作為疫苗及載體奠定基礎。將裂解質粒PHH43-E電轉入牛大腸桿菌中，并通過溫度的改變誘導細菌裂解，即其在37℃條件下生長到對數生長期，然后進行42℃升溫誘導。經溫控誘導裂解質粒表達后可將細胞壁裂解，形成細菌空殼，成功制備了菌影。

牛；致病性大腸桿菌；菌影；制備

菌影（bacterial ghosts）又稱菌蛻，是無繁殖能力、缺乏細胞漿和核酸的細菌空殼，通過噬菌體PhiX174的裂解基因E在革蘭氏陰性菌內表達而形成[1-3]。裂解基因E表達后，細菌的內外膜融合形成跨膜孔道，在滲透壓的作用下，細菌基因組和胞漿等內容物通過跨膜孔道排出，留下細菌空殼，即形成一種空的“菌影”[4-5]。菌蛻完好地保留了菌體表面的各種抗原的天然結構和粘附活性，可以類似活菌體誘導機體產生良好的免疫保護反應[6-7]，此外，研究表明菌影還具有極好的載體和佐劑功能[8]，目前，裂解基因E誘導制備菌影的技術已經廣泛用于多種革蘭氏陰性菌菌影的制備[9-10]。

成功制備菌蛻的關鍵是噬菌體phiX174的裂解基因E在宿主細胞內的高效表達。目前的表達系統有：溫度敏感型λpL/pR-cI857啟動子/阻遏子系統、化學誘導型LacpO-LacIq啟動子/阻遏子系統、Pm-xylS啟動子/阻遏子系統或者tol表達系統。目前應用最多的是λpL/pR-cI857啟動子/阻遏子表達系統。

本試驗擬利用λpL/pR-cI857啟動阻遏系統，通過改變溫度調控裂解基因E的表達，來制備制備致病性大腸桿菌菌影，為進一步研制和開發大腸桿菌新型疫苗及新型佐劑進行前期的探索。

1 材料與方法

1.1材料裂解質粒pHH43-E質粒由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所細菌室惠贈；牛源致病性大腸桿菌為本實驗室分離并保存；Taq DNA聚合酶購自美國Fermentas公司；DL2000 DNA marker購自Takara（大連）公司；氯霉素購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1 大腸桿菌感受態的制備 按照文獻[11]，-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 質粒的電轉及鑒定 將1.2.1制備的感受態細胞從-80℃冰箱中取出置冰上待融化后加入1 μL的裂解質粒pHH43-E，按照常規電轉的方法進行電轉，參數為12.5 kV/cm、200 Ω、25μF、4.9 ms。將電轉后的質粒搖菌并涂板，放置37℃溫箱過夜培養。第2天挑取單菌落進行37℃搖菌，并進行菌液PCR鑒定。

1.2.3 裂解條件的優化 在5 mL含34 μg/mL氯霉素的LB培養液中接種含裂解質粒的菌株，37℃過夜震蕩培養。轉接后37℃培養至OD600值分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2。然后升溫至42℃誘導表達。每隔15 min取樣測定OD600值，直至培養物的OD600值不再下降為止。同時取適量菌液，用無菌PBS稀釋適當倍數后涂板進行菌落計數（每板涂100 μL菌液）。

1.2.4 菌體裂解率的計算 取誘導之前100 μL的菌液和誘導之后的100 μL菌液分別稀釋合適倍數，涂布于含有氯霉素的LB平板，37℃過夜培養，計算活菌數。

裂解率（%）＝（1-誘導后CFU/誘導前CFU）×100%

2 結果

2.1溶菌質粒的鑒定以電轉化后的單菌落的過夜培養物為模板進行菌液PCR鑒定，結果如圖1所示，在1 429 bp處有一條特異性條帶，與預期相符。

圖1 裂解質粒PHH43-E成功轉入大腸桿菌結果圖Fig.1 Plasmid PHH43-E was successfully transferred to E.coli results map

2.2不同初始濃度誘導下的裂解情況觀察42℃誘導后，裂解情況觀察結果，與對照組相比，0.4和0.6時，差別最明顯，因此，0.4和0.6時，裂解效果好。

2.3不同起始濃度裂解曲線分別對起始濃度為0.4、0.6、0.8、1.0和1.2時其進行了裂解曲線的繪制，但因試驗中起始濃度為0.8、1.0和1.2的裂解效果不是很好，所以只對起始濃度為0.4和0.6的裂解曲線進行了分析，由圖3可看出，當初始濃度為0.6時，該曲線較為平穩，且OD值也較低，菌落數較少。因此，起始濃度為0.6時為最佳起始濃度。

2.4 裂解率計算結果將升溫誘導之前和誘導結束后2～3 h的菌液分別用無菌PBS進行105和103倍稀釋，重復3次試驗后取平均數，37℃恒溫箱培養24 h，分別計算誘導前細菌數和誘導后菌液濃度。

裂解率=1-5.8×103/5.2×106=99.89%

3 分析與討論

本試驗將pHH43-E裂解質粒成功轉入大腸桿菌中，含有裂解質粒的大腸桿菌在37℃條件下培養至對數生長期后，升溫誘導制備大腸桿菌菌影。升溫誘導15 min后OD600值達到最高之后下降，在誘導60 min后OD600值下降到最低，同時菌液最為澄清，并穩定持續60 min不再變化。

圖2 不同初始濃度誘導下的裂解結果Fig.2 Under different initial concentration induced cracking results

圖3 裂解曲線的繪制結果Fig.3 Plot results of pyrolysis curve

將不同起始濃度的菌液同時進行升溫誘導，對比其裂解是否有差異，篩選出裂解效率最高的起始濃度。結果顯示，菌液起始濃度OD600值為0.4或0.6左右時升溫誘導，其裂解效率要明顯高于起始濃度OD600為0.8、1.0和1.2時的裂解效率。雖然起始濃度OD600值為0.4和0.6時的裂解效率相近，但是由于菌液起始濃度為0.6時，OD600值較為平穩，因此，本試驗選擇菌液濃度為0.6作為起始菌液誘導濃度。

本試驗中采用的裂解系統為目前應用最多λpL/ pR-cI857溫控表達系統。最初的λpL/pR-cI857系統在溫度低于30℃時，阻遏蛋白cI857的表達使基因E被穩定抑制；溫度高于30℃時，阻遏蛋白cI857熱失活，導致基因E表達；在42℃時，細菌裂解達到最佳狀態。由于30℃時培養細菌不利于菌體的大量繁殖，同時，當溫度由30℃向42℃轉變時，熱沖擊會對細胞表面的抗原決定簇產生影響，因此，通過基因定點突變技術，使λpL/pR啟動子的操縱基因OR2中的一個堿基由T誘變為C，突變后在37℃下也能穩定抑制基因E的表達，經此改造后，該溫控表達表達系統的熱穩定性大大提高[12]，這對細菌菌影的制備提供了便利條件。

在菌影制備過程中，100%的完全裂解往往不易實現，為了達到完全滅活，筆者采用凍干法將制備的菌影凍干兩次，每次置于凍干機中凍干12 h，經過檢測細菌已被完全滅活，其原因可能是細菌在凍干的過程中會有一部分活菌死亡，在不加保護劑的情況下死亡的細菌數量會更多，而且菌影中存留的活菌數量本身很低，導致菌影在凍干過程中存留的少量活菌被全部滅活，但是在此過程中，菌體可能由于反復凍融可能受到破壞，導致其免疫原性降低。因此提高菌影的打孔效率將是今后研究的重點。

參考文獻

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The Preparation of bovine pathogenic Escherichia coli Ghosts

Wang Shixia,Chang Chunlong,Zhai Junjun,Ni Hongbo*
(Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Preparation bovine E.coli bacterial ghost,the as carrier vaccine and lay the foundation.The cleavage of plasmid PHH43-E electro transformed into bovine Escherichia coli,and by the change of temperature induced bacterial lysis,namely the at 37℃ for growth to logarithmic growth phase,then 42℃ for heat induced.The temperature induced cleavage of plasmid expression can be the cell wall lysis,forming bacteria ghosts,that were prepared bacterial ghosts successfully.

Cattle;Pathogenic Escherichia coli;Bacterial shadow;Preparation

S852.61 < class="emphasis_bold"> 文獻標識碼：B

B

1672-9692(2016)08-0006-04

2016-07-01

王士霞（1990-），女，黑龍江人，在讀碩士，研究方向為分子細菌學與免疫學。

倪宏波（1972-），男，黑龍江人，教授，博士生導師，主要從事分子細菌學和免疫學研究。