低氧促進小鼠卵泡顆粒細胞凋亡

杜學海，漫曉丹，寧彩波，周成利，王寶東，劉紅林*

（1.遼寧省畜牧業經濟管理站，遼寧 沈陽 110032；2.南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095）

低氧促進小鼠卵泡顆粒細胞凋亡

杜學海1，漫曉丹2，寧彩波2，周成利1，王寶東1，劉紅林2*

（1.遼寧省畜牧業經濟管理站，遼寧 沈陽 110032；2.南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095）

為研究低氧是否能促進小鼠卵泡顆粒細胞凋亡，將體外培養的小鼠卵泡顆粒細胞分成對照組和低氧處理組。對照組的細胞一直在常規的二氧化碳培養箱內培養，低氧處理組的細胞先在常規二氧化碳培養箱內培養一段時間后放入三氣培養箱內（1%的氧氣，5%的二氧化碳，94%的氮氣）培養，一定時間后收集兩組細胞樣：用流式細胞儀結合Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡情況；用熒光定量PCR檢測HIF1α及BNIP3基因在兩組細胞中的mRNA轉錄水平；用TUNEL染色法檢測兩組細胞的DNA斷裂情況；在小鼠顆粒細胞中過表達HIF1α，檢測BNIP3基因的mRNA轉錄情況。結果表明：與對照組相比，低氧處理能夠顯著促進體外培養的小鼠卵泡顆粒細胞凋亡；低氧處理組HIF1α和BNIP3基因的mRNA轉錄水平顯著高于對照組；低氧處理的小鼠卵泡顆粒細胞內有明顯的核固縮現象，但DNA斷裂多發生在胞質內；在小鼠顆粒細胞中過表達HIF1α能夠引起BNIP3的mRNA轉錄水平升高。這些結果表明低氧處理能促進小鼠卵泡顆粒細胞的凋亡及細胞內HIF1α與BNIP3基因的表達量升高；由低氧處理后小鼠卵泡顆粒細胞內DNA斷裂多發生在細胞質內，推測低氧引起小鼠顆粒細胞凋亡可能是通過線粒體凋亡途徑實現的。

低氧；HIF1α；BNIP3；小鼠卵泡顆粒細胞；凋亡機制

低氧誘導因子1（hypoxia inducible factor1，HIF1）是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種轉錄因子，在哺乳動物的生長發育、生理和病理反應過程中起著重要作用[1]。HIF1由HIF1α和HIF1β兩個亞單位組成，其中HIF1α是主要的氧調節亞基，也是功能亞基，一般認為HIF1β在細胞內的表達量是恒定的，HIF1在細胞內的表達量主要有HIF1α決定[2]。在低氧條件下，HIF1α很穩定，并會移位到細胞核中，與核中的HIF1β結合形成異二聚體HIF1發揮調節作用[3]，研究發現HIF1調控的下游靶基因近80種，主要與血管生成、細胞糖代謝、細胞增殖、細胞存活和細胞凋亡等細胞生物學行為有關[4]。在常氧條件下，HIF1通過泛素-蛋白酶體路徑迅速降解，所以低氧誘導被認為是細胞內產生HIF1α應答的主要原因[5]。BNIP3是一種促凋亡蛋白，屬于Bcl-2家族成員的BH3-only促凋亡蛋白亞類，其分子中僅含有BH3結構域和羥基末端的跨膜結構TM[6]。BNIP3可通過BH3結構與抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL等形成異二聚體促進細胞凋亡[7]；也可依賴于其羥基末端TM結構的線粒體錨定作用促進細胞凋亡[8]。BNIP3啟動子區含有一個與HIF1轉錄相關的功能結合位，即缺氧反應元件（hypoxia-respome element，HRE），其在低氧條件下與HIF1發生緊密結合[8]；在細胞系內過表達HIF1α能促進BNIP3的表達[8]，低氧處理牛黃體細胞48 h可見明顯核固縮和DNA碎片等細胞凋亡特征以及BNIP3和caspase-3的表達增加[9]。這些研究報道表明BNIP3是一種低氧應答基因，且受HIF1（HIF1α）的直接調控[8]。動物機體內各組織器官常因供血不足而引發低氧應激并進一步誘發包括細胞凋亡在內的多種細胞應答反應[7]。哺乳動物卵泡發育過程中也存在低氧應激，卵泡在發育過程中會逐漸變大并在其內部形成很大的腔隙，腔隙中存在大量卵泡液，卵丘顆粒細胞和卵母細胞就被卵泡液包裹其中，被卵泡液包裹的卵丘顆粒細胞和卵母細胞周圍的脈管分布減少，供血迅速下降，形成低氧環境[5]。那么低氧應激能否直接促進小鼠卵泡顆粒細胞的凋亡，如果能

1.1試驗材料

1.1.1 試驗動物 試驗所用小鼠為3～4周齡健康雌性昆明白小白鼠，購自南京市青龍山動物繁殖中心。

1.1.2 主要試驗試劑 熒光定量試劑盒購、大腸埃希菌（Escherichiacoli，E.coli）DH 5α、T4DNA連接酶、PCR產物擴增酶以及所用限制性內切酶均購自TaKaRa公司；pcDNA3.1由本實驗室保存；DNA產物純化與質粒提取試劑盒購自TIANGEN生物公司；PMSG購自寧波第二激素場；點突變試劑盒購自諾唯贊生物公司；TUNEL熒光試劑盒購自Roche公司；Annexin V-FITC染色試劑盒購自碧云天生物公司；細胞培養所用的耗材及轉染試劑lip2000購自Invitrogen公司；培養基、PBS及血清購自Life technologies公司。

1.2試驗方法

1.2.1 小鼠卵泡顆粒細胞的獲得與培養 小鼠腹腔注射PMSG（10 U）46 h后，頸椎脫臼處死，無菌條件下迅速取出雙側卵巢，立即放入盛有完全培養基的小培養皿（35 mm×15 mm）內，在體式顯微鏡下用1 mL注射器針頭扎破卵泡，釋放出顆粒細胞。積攢一定量顆粒細胞后，用移液槍吸出，吹打均勻后加入含有完全培養基的6孔培養板中培養。2～3 d換一次液，待孔內細胞貼壁達到80%左右做試驗處理。

1.2.2 Annexin V-FITC凋亡染色 體外培養的小鼠卵泡顆粒細胞，經不同氧濃度處理后，收集上層細胞培養液（含有因處理死亡的細胞），PBS洗1次，用不含EDTA的胰酶室溫消化顆粒細胞5 min，把收集的培養液和消化下來的細胞混合1 000 r/min離心5 min，棄上清，然后用PBS重懸細胞。重復PBS洗滌2～3次，細胞計數后取50 000～100 000個細胞1 000 r/min離心5 min后，棄上清加入195 μL Annexin V-FITC反應緩沖液和5 μL的annexin其機制又是什么。帶著這些問題，筆者做了一系列試驗并證實了低氧能夠促進體外培養的小鼠卵泡顆粒細胞凋亡，且其凋亡機制可能是BNIP3介導的線粒體凋亡通路。

1 材料與方法

V-FITC染料25℃反應10 min，1 000 r/min離心5 min后，棄上清，加入190 μL的PI反應緩沖液和10 PI染料，輕微震蕩混勻，避光放在冰上待流式細胞儀檢測。

1.2.3 細胞總RNA的提取與反轉錄 采用Trizol提取法（Invitrogen公司）提取體外培養的小鼠卵泡顆粒細胞總RNA，詳細步驟參照說明書進行。采用15 min快速反轉錄酶試劑盒（TaKaRa公司）對提取的總RNA進行反轉錄，具體步驟見試劑盒使用說明書，獲得的cDNA產物于-80℃保存備用。

1.2.4 HIF1α-pcDNA3.1真核表達載體的構建以小鼠卵泡顆粒細胞的cDNA為模板，用引物P1（見表1）擴增得到HIF1α編碼區的全長。條件為98℃預變性30 s后，進行如下循環：95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，循環35次，最后延伸7 min。所得PCR產物進行凝膠電泳，對凝膠上2 500 bp左右的條帶進行膠回收，所得純化產物用BamHI和XhoI雙酶切，酶切產物進行產物純化，與經同樣酶處理的真核表達載體pcDNA3.1連接，經過轉化、涂板、挑菌、擴培、測序等步驟后得到HIF1α過表達載體HIF1α-pcDNA3.1。

表1 本文所用引物Table1 Primer used in this study

1.2.5 質粒轉染 采用lip2000脂質體法做轉染試驗：轉染分對照組和試驗組，試驗組加入的是HIF1α-pcDNA3.1重組質粒，對照組加入的是pcDNA3.1空載質粒；轉染前吸棄培養基，用2 mL無抗PBS沖洗1～2次，換1.5 mL全無培養基，放入37℃二氧化碳培養箱；配A液：3 μg質粒加入opti培養基使終體積為250 μL，B夜：10 μL脂質體加入240 μL Opti培養基使終體積為250 μL；配好后，靜止5 min，B液加入A液，20 min后轉染，500 μL每孔，4～6 h后換成含15%胎牛血清、1%雙抗的DMEM F12培養基。

1.2.6 熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR儀對不同處理小鼠卵泡顆粒細胞中HIF1α、BNIP3和GAPDH基因mRNA表達水平進行檢測，所用定量引物分別為P2、P3和P4（見表1）。Real-time PCR反應體系及反應條件嚴格參照2×SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa公司）試劑盒使用說明書。每個樣品重復3次，取其平均值，用2-△△Ct法計算各個基因表達量。

1.2.7 TUNEL凋亡檢測 經處理后的小鼠卵泡顆粒細胞用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2次，每次5 min；用0.2%的Triton X-100處理5 min，PBS洗2次，每次5 min；用含0.3%BSA的封閉液封閉15 min，PBS洗2次，每次5 min；加入50 μL配置好的TUNEL反應液，并用剪好的封口膜貼在蓋上，防治蒸發，于37℃濕盒內反應60 min；PBS洗3次，每次5 min；200 μL的DAPI室溫作用10 min，PBS洗3次，每次5 min；于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.3數據分析所有數據均用X±SED表示，用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析，采用獨立樣本t檢驗比較兩組間差異，P＜0.05時確定為差異顯著，P＜0.01確定為差異極顯著[10]。

2 結果

2.1低氧促進小鼠卵泡顆粒細胞凋亡同一批次分離獲得的小鼠卵泡顆粒細胞進行體外培養，并分為對照組和低氧處理組，對照組一直在常規二氧化碳培養箱內培養；低氧處理組在常規二氧化碳培養箱內培養72 h后，轉至低氧培養箱（三氣培養箱，1%的氧氣，5%的二氧化碳，94%的氧氣）繼續培養，48 h后收集兩組顆粒細胞做Annexin V-FITC凋亡染色，流式細胞儀上檢測兩組細胞凋亡情況。發現低氧處理組的顆粒細胞凋亡率顯著高于對照組（見圖1），表明低氧處理能夠促進體外培養的小鼠卵泡顆粒細胞凋亡。

圖1 低氧處理促進小鼠卵泡顆粒細胞凋亡Fig.1 Hypoxia promotes the apoptosis of follicular granulosa cells in mice

2.2低氧促進小鼠卵泡顆粒細胞內BNIP3的表達有研究表明低氧應激能引起心肌細胞內BNIP3的表達量升高，進而引起心肌細胞凋亡[11-12]。BNIP3是一種線粒體促凋亡蛋白，能夠引起細胞凋亡和壞死，且BNIP3的表達受HIF1a調控[8]。那么小鼠卵泡顆粒細胞中是否也存在這種關系呢？筆者做了以下試驗來驗證。一是采用熒光定量PCR檢測低氧處理的小鼠卵泡顆粒細胞中HIF1a和BNIP3表達情況；二是在小鼠卵泡顆粒細胞中過表達HIF1a，觀察BNIP3的表達情況。結果表明低氧處理組的小鼠卵泡顆粒細胞中HIF1a和BNIP3的mRNA水平顯著高于常氧組（對照組）；在小鼠卵泡顆粒細胞中過表達HIF1a能顯著促進BNIP3的mRNA轉錄。這說明低氧處理能引起小鼠卵泡顆粒細胞中BNIP3的表達升高；且在小鼠卵泡顆粒細胞中BNIP3的表達同樣受HIF1a的調控。

2.3低氧處理的小鼠卵泡顆粒細胞DDNNAA斷裂多發生在細胞質內用TUNEL法檢測體外培養小鼠卵泡顆粒細胞的凋亡情況，發現低氧處理的小鼠卵泡顆粒細胞內有明顯的核固縮現象，但DNA斷裂多發生在細胞質內（見圖3）。由此可知細胞質內只有線粒體內含有DNA，說明低氧應激引起的小鼠卵泡顆粒細胞凋亡很可能是由線粒體功能障礙開始的。

3 討論

動物機體內的低氧應激主要是因為供血不足產生的，如腫瘤組織中因細胞分裂生長速度太快而引起的低氧應激[13-14]，牛黃體溶解時而引起的低氧應激[7]，心血管系統中因間斷性供血而引起的低氧應激[15]。這些現象都有一個共同點，就是應激組織細胞內的HIF1a的表達量升高，并伴隨著細胞凋亡[7，13-15]。在卵泡發育過程中，卵泡顆粒細胞的快速增值，以及卵泡液不斷增多，使得卵泡腔內血管分布迅速減少，供血水平迅速降低[5]，便有可能產生低氧應激，也就是說，在卵泡發育過程中也存在低氧應激。本次試驗發現，與對照組相比，體外培養的小鼠卵泡顆粒細胞在低氧處理條件下發生顯著凋亡，細胞內HIF1α的表達量顯著升高。這一試驗結果與上述研究報道[7，13-15]相一致，說明低氧確實能夠促進小鼠卵泡顆粒細胞的凋亡。在實時熒光定量PCR試驗中發現，低氧處理不僅促進了卵泡顆粒細胞中HIF1α的轉錄，同時還促進了BNIP3的轉錄；且在卵泡顆粒細胞中過表達HIF1α能極顯著地引起BNIP3的表達。這說明低氧能夠促進小鼠卵泡顆粒細胞內BNIP3的表達，且BNIP3的表達很有可能受HIF1α的調控。BNIP3是Bcl-2蛋白家族中BH3-only蛋白的一種，能夠參與細胞自噬和凋亡[16]。有研究表明，在低氧條件下，BNIP3能夠引起線粒體缺陷并進一步引起細胞凋亡或死亡[13，16]，且BNIP3的表達受HIF1α的調控[11]。在本試驗中發現，低氧處理體外培養的小鼠卵泡顆粒細胞不僅出現了明顯的核固縮現象，而且在胞質內還出現了DNA斷裂現象。細胞質內只有線粒體中存在DNA，這說明低氧處理直接導致了線粒體的功能障礙。綜合前人研究報道及上述試驗結果，推測低氧應激誘導的小鼠卵泡顆粒細胞凋亡很可能是通過BNIP3介導的線粒體凋亡通路實現的。有文獻表明卵泡顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的主要原因[17]，而低氧能夠促進卵泡顆粒細胞凋亡，因此卵泡發育過程中的低氧應激也可能是引起卵泡閉鎖的原因之一。

圖2 低氧促進小鼠卵泡顆粒細胞內BNIP3的表達Fig.2 Hypoxia promotes the expression ofBNIP3in mouse follicular granulosa cells

圖3 低氧處理引起小鼠卵泡顆粒細胞核固縮和胞質DNA斷裂Fig.3 Hypoxia caused mouse follicular granulosa cells nuclear condensation and cytoplasmic DNA fragmentation

[1]Semenza G L.Targeting HIF-1 for cancer therapy[J]. Nature Reviews Cancer, 2003, 3(10): 721-732.

[2]胡恒通，彭波，馬清涌，等.HIF-1α與NF-κB通路對胰腺癌缺氧調節及腫瘤進展的作用[J].西安交通大學學報：醫學版，2010，3（3）：274-278.

[3] Semenza G L. HIF-1 and tumor progression: pathophysiology and therapeutics[J]. Trends in molecular medicine,2002,8(4):S62-S67.

[4]Lee J W,Bae S H,Jeong J W,et al.Hypoxia-inducible factor(HIF-1)α:its protein stability and biological functions[J].Experimental & molecular medicine, 2004, 36(1): 1-12.

[5]杜學海，曹蕊，肖鵬，等.不同處理小鼠卵巢組織中HIF1α基因的表達分析及其真核表達載體構建[J].南京農業大學學報，2014，37（6）：137-142.

[6]Ray R,Chen G,Velde C V,et al.BNIP3 heterodimerizes with Bcl-2/Bcl-XL and induces cell death independent of a Bcl-2 homology 3 (BH3)domain at both mitochondrial and nonmitochondrial sites[J]. Journal of Biological Chemistry,2000,275(2):1439-1448.

[7]Nishimura R,Komiyama J,Tasaki Y,et al.Hypoxia promotes luteal cell deathin bovine corpus luteum[J]. Biology of reproduction, 2008,78(3):529-536.

[8]Vasagiri N,Kutala V K.Structure,function, and epigenetic regulation of BNIP3:a pathophysiologicalrelevance[J].Molecularbiology reports,2014,41(11):7705-7714.

[9]Youle R J,Strasser A.The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death[J].Nature reviews Molecular cell biology,2008,9(1):47-59.

[10]韓杰，白子山，劉旸.刺五加多糖對免疫應激小鼠免疫器官指數和腸黏膜淋巴細胞數量的影響[J].現代畜牧獸醫，2015（8）：7-10.

[11]Zhou Y F,Zheng X W,Qi G X,et al.The effect of hypoxia-inducible factor 1-alpha on hypoxia-induced apoptosis in primary neonatal rat ventricular myocytes[J].Cardiovascular journal of Africa,2010,21(1):37.

[12]Regula K M,Ens K,Kirshenbaum L A.Inducible expression of BNIP3 provokes mitochondrial defects and hypoxia-mediated cell death of ventricular myocytes[J]. Circulation research,2002,91(3):226-231.

[13]Chiavarina B,Whitaker-Menezes D,Migneco G, et al.HIF1-alpha functions as a tumor promoter in cancer-associated fibroblasts,and as a tumor suppressor in breast cancer cells:Autophagy drives compartment-specific oncogenesis[J]. Cell Cycle, 2010, 9(17): 3534-3551.

[14]Greijer A E,Van der Wall E.The role of hypoxia inducible factor 1(HIF-1)in hypoxia induced apoptosis[J].Journal of clinical pathology,2004,57(10):1009-1014.

[15]Diwan A,Krenz M,Syed F M,et al.Inhibition of ischemic cardiomyocyte apoptosis through targeted ablation of Bnip3 restrains postinfarction remodeling in mice[J]. The Journal of clinical investigation,2007,117 (10):2825-2833.

[16]Brunelle J K,Letai A.Control of mitochondrial apoptosis by the Bcl-2 family[J].Journal of cell science,2009,122(4):437.

[17]Du X H,Zhou X L,Cao R,et al.FSH-induced p38-MAPK-mediated dephosphorylation at serine 727 of the signal transducer and activator of transcription 1 decreases Cyp1b1 expression in mouse granulosa cells[J].Cellular signalling,2015,27(1):6-14.

Hypoxia promotes the apoptosis of follicular granulosa cells in mice

Du Xuehai1,Man Xiaodan2,Ning Caibo2,Zhou Chengli1, Wang Baodong1,Liu Honglin2*
(1.Liaoning Provincial Animal Husbandry Economy station,Liaoning Shenyang 110032; 2.College of Animal Sciences and Technology,Nanjing Agricultural University,Jiangsu Nanjing 210095)

The study was conducted to examine whether hypoxia induces granulosa cells apoptosis in mouse follicular.The cultured mouse granulosa cells were divided into control and hypoxia groups,the control group cells were cultured in carbon dioxide incubator,the hypoxia group cells were cultured in three gas(1%oxygen,5%carbon dioxide,94%nitrogen)incubator after a certain period of time in carbon dioxide incubator.The samples were collected after a certain period of time:Cells apoptosis were detected by flow cytometry with Annexin V/PI double staining;the mRNA transcription levels of HIF1αand BNIP3 were detected by real-time PCR;intracellular DNA breakage were detected by TUNEL;the mRNA transcription levels of HIF1αand BNIP3 were detected after overexpression of HIF1α in cultured mouse granulosa cells.The results indicated: Compared with the control group, hypoxia can significantly promote the apoptosis of cultured mouse granulosa cell;hypoxia can increase the mRNA transcription levels of HIF1αand BNIP3;hypoxia can cause the mouse follicular granulosa cells nuclear condensation and cytoplasmic DNA fragmentation;overexpression of HIF1α can increase the mRNA transcription levels of BNIP3 incultured mouse granulosa cells.These results indicate that hypoxia promotes the apoptosis of mouse follicular granulosa cells probably through mitochondrial apoptosis pathway.

Hypoxia;HIF1α;BNIP3;Mouse follicular granulosa cells;Apoptosis mechanism

S814.1 < class="emphasis_bold"> 文獻標識碼：B

B

1672-9692(2016)08-0018-06

2016-06-03

杜學海（1987-），男，碩士研究生，主要從事動物遺傳育種與繁殖相關工作。

劉紅林（1966-），男，教授，博導，主要從事動物育種學與動物發育生物學研究工作。