復(fù)方葛根片對(duì)衰老大鼠胸主動(dòng)脈損傷的保護(hù)作用

李允江 ，孫琳 ，畢云生 ， 張淑瑜，于燕莉*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250035；2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，山東 濟(jì)南 250031)

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【藥理與毒理】

復(fù)方葛根片對(duì)衰老大鼠胸主動(dòng)脈損傷的保護(hù)作用

李允江1，孫琳1，畢云生2， 張淑瑜2，于燕莉2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250035；2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，山東 濟(jì)南 250031)

為研究復(fù)方葛根片對(duì)D-半乳糖致大鼠衰老后血清中同型半胱氨酸(Hcy)水平的影響及胸主動(dòng)脈損傷的保護(hù)作用，將大鼠分為模型組，正常組，復(fù)方葛根片高、中、低劑量組。采用皮下注射D-半乳糖的方法制備大鼠衰老模型，運(yùn)用AU5800全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清中Hcy的含量，運(yùn)用SPSS16分析各Hcy含量和體重差異。對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察血管的組織病理學(xué)病變。研究結(jié)果表明，模型組與正常組以及各給藥組與模型組的Hcy水平、體重均存在顯著性差異(P<0.01))。復(fù)方葛根片各劑量組對(duì)胸主動(dòng)脈血管具有不同程度的保護(hù)作用，高劑量組的保護(hù)作用最明顯。 研究認(rèn)為復(fù)方葛根片能降低D-半乳糖致衰老大鼠血清中Hcy水平，并對(duì)胸主動(dòng)脈的血管損傷具有保護(hù)作用。

D-半乳糖 ；同型半胱氨酸；老齡鼠

根據(jù)2011年中國(guó)第六次人口普查結(jié)果預(yù)計(jì)，至2037年我國(guó)老齡化人口將突破4億[1]。心腦血管疾病是威脅老年人口健康的重要疾病之一，在造成老年人死亡的疾病中占首位。Ungvari等[2]發(fā)現(xiàn)65～74 周歲的老年人中，因心腦血管疾病死亡的人數(shù)占總死亡人數(shù)的 40%；而在年齡大于等于 85 歲的人群中，這一比例升至約 60%。Wald等[3]研究發(fā)現(xiàn)血漿中的同型半胱氨酸(Hcy)含量與心血管疾病的發(fā)生成正相關(guān)，還有很多學(xué)者的研究結(jié)果都證實(shí)了Hcy是獨(dú)立的心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)因子。

D-半乳糖衰老動(dòng)物模型是一種比較成熟的衰老動(dòng)物模型，該造模方法相比于其他幾種衰老模型得到的結(jié)果更加穩(wěn)定。秦紅兵等[4]研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖建立亞急性衰老模型可使小鼠記憶功能下降、氧自由基產(chǎn)物增加、抗氧化能力和免疫功能降低，認(rèn)為此模型可用于行為學(xué)、抗氧化以及免疫等方面的抗衰老藥效研究。本課題組的前期研究也已經(jīng)顯示，D-半乳糖能夠升高衰老大鼠血清中Hcy的水平。課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方葛根片(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院的院內(nèi)制劑)具有良好的抗衰老作用，但其對(duì)血管的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將采用D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠衰老模型，研究復(fù)方葛根片對(duì)胸主動(dòng)脈損傷以及血清Hcy水平的影響，以期揭示其抗衰老作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體級(jí)實(shí)驗(yàn)用雄性Wistar大鼠50只，體重160～180 g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK(魯)2013-0009)，飼養(yǎng)在濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器及試藥

精密電子天平(JA3003)，上海精科儀器公司；醫(yī)用低速離心機(jī)(B600A)，北京白洋醫(yī)用離心機(jī)有限公司；D-半乳糖(15121101)，張家港市思普生化有限公司；全自動(dòng)生化分析儀(AU5800)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；水合氯醛(10%，批號(hào)：20151023)，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院制劑室；復(fù)方葛根片(0.4 克/片，相等于含生藥材0.3 g，批號(hào)：20151026)，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院制劑室，多聚甲醛溶液(自配);Tissue-TEK全自動(dòng)組織脫水機(jī)，德國(guó)MEDITE公司; Tissue-TEK全自動(dòng)染色機(jī)，德國(guó)MEDITE公司；Hcy測(cè)定試劑盒(批號(hào)：2016040016)，浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司。

2 方法

2.1 分組及給藥

Wistar大鼠按體重隨機(jī)分成5個(gè)組，即正常組、模型組、復(fù)方葛根片高劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)高劑量組)、復(fù)方葛根片中劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)中劑量組)和復(fù)方葛根片低劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)低劑量組)，每組10只。每組每天正常喂食、喂水；模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組每天定時(shí)腹腔注射D-半乳糖150 mg/kg，正常組注射同樣體積的生理鹽水，按照體重每100 g注射1 mL的量進(jìn)行操作。根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)中的折算系數(shù)(0.018)確定灌胃劑量，高劑量組、中劑量組和低劑量組按照和人的等效劑量(中劑量)2.26 g/d用灌胃器每天定時(shí)灌胃給藥，灌胃前對(duì)大鼠禁食禁水2 h，確保空腹給藥。正常組根據(jù)各大鼠體重按照每100 g注射1 mL的劑量進(jìn)行蒸餾水灌胃。以周為單位測(cè)量各組體重，根據(jù)體重對(duì)相應(yīng)的給藥劑量進(jìn)行調(diào)整。直至給藥7周后結(jié)束。

2.2 指標(biāo)的檢測(cè)

給藥全部結(jié)束后，禁食不禁水12 h，腹腔注射水合氯醛，用5 mL真空采血管經(jīng)腹主靜脈取血，輕微晃動(dòng)使充分混合后靜置片刻于低溫離心機(jī)中3 000 r/min離心分離血清，并置于eppendoff管中，保存在-80 ℃的超低溫冰箱中備用。取血后快速剪下胸主動(dòng)脈，用生理鹽水洗去殘留的血液。用眼科手術(shù)剪去除血管外圍的脂肪組織，然后用足量的多聚甲醛溶液進(jìn)行固定并保存。取200 μL血清(足量)，置于全自動(dòng)生化分析儀中檢測(cè)Hcy的含量；用全自動(dòng)脫水機(jī)對(duì)血管組織進(jìn)行脫水，固定包埋，進(jìn)而用全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行HE染色。顯微鏡下觀察血管的組織病理切片，分析藥物對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈的影響。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法學(xué)

用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16對(duì)大鼠血清中Hcy的水平、體重進(jìn)行單因素方差分析，表格數(shù)據(jù)按照x±s的形式表示，比較各組Hcy水平、體重的差異，按照P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)定義差異是否顯著。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況差異性

正常組大鼠毛色順滑白亮，精神矍鑠；模型組精神萎靡，毛色粗糙，呈現(xiàn)出輕微的黃色，脊背高高彎起。各給藥組精神狀態(tài)良好，但毛色不是特別白凈光滑，給藥組之間精神狀態(tài)差異不顯著。各組給藥前的體重均無(wú)顯著性差異(P>0.01)，提示隨機(jī)分組成功；各給藥組大鼠體重用藥后比用藥前均顯著增加(P<0.01)，但體重增加量正常組大于高劑量組大于中劑量組大于低劑量組大于模型組。用藥后正常組體重與模型組相比顯著提高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；復(fù)方葛根片各給藥組與模型組相比，大鼠體重顯著提高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。體重結(jié)果提示D-半乳糖能降低大鼠體重增長(zhǎng)的速度，復(fù)方葛根片能降低D-半乳糖對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠用藥前后體重的差異(x±s)Table 1 Body weight differences of rats before and after drugs

3.2 大鼠血清Hcy的水平

經(jīng)SPSS分析，Hcy水平的方差不齊(P=0.048<0.05)。模型組與對(duì)照相比，Hcy水平顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示模型制作成功；高、中、低3個(gè)劑量組與模型組相比，Hcy水平均顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示復(fù)方葛根片能明顯降低衰老大鼠血清中Hcy的水平。但各給藥組與正常組相比均有顯著性差異(P<0.01)，說(shuō)明高、中、低3劑量組均不能使Hcy水平降至正常水平。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠Hcy的水平(x±s)Table 2 Hcy level of each rat group (x±s)

3.3 大鼠胸主動(dòng)脈血管組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果

如圖1所示，模型組的胸主動(dòng)脈在鏡下可以發(fā)現(xiàn)血管管腔不規(guī)則，局部血管內(nèi)膜水腫并伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)膜增厚，局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞脫失，血管組織及平滑肌增生。正常組血管管腔規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)腫脹，內(nèi)膜光滑，未見(jiàn)脂質(zhì)沉淀，血管內(nèi)膜、中膜以及血管壁未見(jiàn)纖維組織及平滑肌增生，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。低劑量組血管管腔不規(guī)則，管腔內(nèi)輕度浸潤(rùn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞雖未脫落但出現(xiàn)水腫，血管內(nèi)膜及血管壁無(wú)明顯水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。中劑量組的動(dòng)脈血管未見(jiàn)明顯狹窄，內(nèi)膜及管壁未見(jiàn)水腫及增生肥厚，無(wú)脂質(zhì)沉淀，局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞輕度水腫。高劑量組血管管腔較規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)水腫，血管內(nèi)膜無(wú)脂質(zhì)沉淀，血管壁未見(jiàn)明顯纖維組織及平滑肌增生，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 大鼠胸主動(dòng)脈血管組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果(×100，HE)Fig.1 Histopathological examination results of rat thoracic aorta (×100, HE)

4 討論

心腦血管疾病是我國(guó)死亡率最高的疾病，在老年人中表現(xiàn)的最為突出，并且目前增長(zhǎng)速度依然很快。同時(shí)，心腦血管疾病多是從血管病變上開(kāi)始，所以有效防治血管老化對(duì)于預(yù)防和治療心腦血管疾病具有重要意義。

Vigen等[5]研究發(fā)現(xiàn)血管功能障礙與衰老相關(guān)疾病的關(guān)系密切。從血管入手研究延緩衰老是一種捷徑。Hcy是人體生命活動(dòng)代謝的正常產(chǎn)物，當(dāng)人們食用含蛋氨酸的蛋白質(zhì)后，就會(huì)通過(guò)體內(nèi)的蛋氨酸代謝途徑生成，是谷胱甘肽以及S-AMe生成的中間產(chǎn)物。其中S-AME是人體內(nèi)良好的甲基供體，是一種不可或缺的生命物質(zhì)，能夠保證體內(nèi)的生化反應(yīng)按照正確而有效的方式進(jìn)行。也就是說(shuō)食用的蛋氨酸先轉(zhuǎn)換為同型半胱氨酸，再經(jīng)過(guò)一系列的生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽和S-AMe。但是一旦機(jī)體由于種種原因而缺乏維生素B族的一些元素、葉酸，以及個(gè)別金屬元素比如鋅等，就會(huì)使生化反應(yīng)的某些環(huán)節(jié)因缺少反應(yīng)物而無(wú)法完成正常的轉(zhuǎn)化過(guò)程，同型半胱氨酸的利用減少，會(huì)使體內(nèi)同型半胱氨酸含量升高，而生成谷胱甘肽和S-腺苷蛋氨酸的途徑受阻，二者在體內(nèi)的含量因此而降低。鮑溪荷等[6]研究發(fā)現(xiàn)甲鈷胺可能通過(guò)降低循環(huán) Hcy 水平降低 T2DM患者尿 MCP-1、TGF-β1 排泄，進(jìn)而減輕腎臟局部增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。楊安寧等[7]研究發(fā)現(xiàn)Hcy可能影響了甲硫氨酸循環(huán)中 DNMTs 的活性，導(dǎo)致 AS相關(guān)基因發(fā)生 DNA 甲基化改變，進(jìn)而引起泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中膽固醇代謝紊亂。Boushey等[8]發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)的Hcy水平每升高5 μmol/L,患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)增高70%,患腦血管病的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增高50%，可見(jiàn)高Hcy水平的危險(xiǎn)性非常高。孫衛(wèi)華等[9]研究發(fā)現(xiàn)降低 Hcy濃度有益于延緩糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。目前，常用葉酸、維生素B12、維生素B6以及含其有效成分的藥物降低Hcy水平。然而葉酸雖可通過(guò)降低Hcy的水平來(lái)減少發(fā)生心腦血管疾病的可能性，但是一旦病人患有了心腦血管疾病，服用葉酸卻不能治愈疾病。Loscalzo[10]研究發(fā)現(xiàn)Hcy可通過(guò)介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖以及基質(zhì)形成,從而產(chǎn)生有害作用。付偉光等[11]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)冠心病患者 Hcy等水平的變化，有助于了解冠心病病程發(fā)展，預(yù)測(cè)冠心病病變的嚴(yán)重程度，指導(dǎo)臨床合理用藥。Xu 等[12]在用一定濃度的同型半胱氨酸誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)粘附分子1 以及PAI-1 在血管內(nèi)產(chǎn)生，而這兩種物質(zhì)是動(dòng)脈血管發(fā)生病變的初始物質(zhì)，說(shuō)明Hcy能夠誘導(dǎo)這兩種物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，能夠誘導(dǎo)血管的動(dòng)脈硬化的發(fā)生。Jia等[13]研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病血管病并發(fā)癥中，Hcy可損傷血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，從而影響血管的功能。于燕莉等[14]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方葛根片能夠降低D-半乳糖致衰老大鼠模型引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而Gonzalez等[15]研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠誘導(dǎo)胰島素受體信號(hào)通路，從而降低衰老器官的自噬反應(yīng)。而自噬反應(yīng)可以清除體內(nèi)在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤蛋白等物質(zhì)，起到保護(hù)血管的作用。這可能是復(fù)方葛根片延緩衰老的一條作用途徑，但具體機(jī)制和其他作用途徑還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方葛根片能夠降低衰老大鼠Hcy的水平，并且呈現(xiàn)出了一定的量效關(guān)系，血管的組織病理切片顯示復(fù)方葛根片對(duì)血管的結(jié)構(gòu)具有一定的保護(hù)作用。Loscalzo[10]認(rèn)為葉酸降低Hcy具有劑量依賴(lài)性，其促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖以及基質(zhì)的形成從而對(duì)血管具有一定的損害作用。所以，復(fù)方葛根片在這方面與葉酸相比具有有一定的優(yōu)勢(shì)。

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Protective effect of compound puerarin tablet on thoracic aorta injury of aged rats

LI Yun-jiang1，SUN Lin1，BI Yun-sheng2，ZHANG Shu-yu2，YU Yan-li2*

(1.School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Department of Pharmacy, General Hospital of Jinan Military Command, Jinan 250031, China)

∶We divided rats into model group and normal group, and high, middle and low dose group of compound puerarin tablet to investigate the impact of compound puerarin tablet on D-galactose induced serum homocysteine (Hcy) level and protective effect on thoracic aorta injury of aged rats. We employed subcutaneous D-galactose injection to establish rats aging model, AU5800 automatic biochemical analyzer to detect Hcy content in rats serum, and SPSS16 to analyze Hcy content and weight difference of each group. We also performed HE staining to rats thoracic aorta and observed its pathological changes with a light microscope. Results show that significant difference (P<0.01) exists in Hcy level and weight of model group and normal group, each dose group and model group. Different dose groups have different protective effects on thoracic aortic vessels, especially for the high dose group having best protective effect. We discover that compound puerarin tablets can reduce Hcy levels in D-galactose induced old rats serum and have protective effects on vascular injury of thoracic aorta.

∶ D-galactose; Homocysteine; aged rat

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.010

2016-06-27

李允江(1990—)，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。Email:291484173@qq.com

*通信作者，于燕莉，主任藥師。Email：yuyanli323@sohu.com

R285.5

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