功勞木中生物堿類成分抗氧化活性研究

朱姮，文蕾，耿巖玲，王曉，賈文婷，王岱杰*，延云洪

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；3. 山東省濟南第九中學，山東 濟南 250022)

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【中藥與天然活性產物】

功勞木中生物堿類成分抗氧化活性研究

朱姮1，文蕾1，耿巖玲2，王曉2，賈文婷2，王岱杰2*，延云洪3

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；3. 山東省濟南第九中學，山東 濟南 250022)

利用DPPH法測定功勞木中生物堿成分的抗氧化活性，采用pH-區帶精制逆流色譜分離出小檗堿、藥根堿、巴馬汀、非洲防己堿和千金藤寧堿5種成分。通過測定功勞木總生物堿以及單體生物堿成分對DPPH自由基清除力，來評價功勞木中主要生物堿類成分的體外抗氧化能力。結果顯示，在0～25 μg/mL范圍內DPPH溶液濃度與吸光度呈線性正相關關系。功勞木總生物堿、小檗堿、藥根堿、巴馬汀、非洲防己堿以及千金藤寧堿的半抑制濃度(IC50)依次為0.07、0.32、0.24、0.20、0.18、0.59 mg/mL。因此，功勞木生物堿類成分具有一定的抗氧化能力，且隨生物堿濃度的升高而增強，總生物堿抗氧化能力強于單體成分。功勞木生物堿抗氧化活性可能為協同效應。

功勞木；生物堿；抗氧化活性

功勞木為小檗科植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.) Carr.或細葉十大功勞Mahoniafortunei(Lindl.) Fedde的干燥莖[1]，其性味苦、寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，主治濕熱瀉痢、黃疸尿赤、目赤腫痛、胃火牙痛和瘡癤癰腫等癥[2]。功勞木中生物堿類化合物類型主要為異喹啉類，包括藥根堿、巴馬汀和小檗堿等，異喹啉類生物堿具有抗菌、抗腫瘤、鎮痛、抗心律失常、抗血小板聚集、降壓和調節免疫功能等多種藥理活性[3-10]。此外，異喹啉類生物堿還具有能迅速且廣泛地分布于多個組織和器官的藥動學特征，可以很好地被機體吸收[11]。

DPPH法[12-17]是利用DPPH(1,1-Dipheny-2-picrylhydrazyl,1,1-二苯代苦肼基)的乙醇或甲醇溶液呈深紫色，在517 nm處有強吸收，加入受試樣品后，由于自由基被清除而產生顏色變化的特性用以表明樣品抗氧化活性的方法。目前，DPPH法已被廣泛用于自由基清除能力的定量分析[18-20]。本實驗采用DPPH法，測定功勞木中生物堿總樣以及單一生物堿成分的抗氧化活性。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

功勞木購于安徽亳州藥材市場，經山東中醫藥大學李佳教授鑒定為小檗科植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.)Carr的干燥莖。DPPH(95%，德國Sigma-Aldrich公司)；氯仿、甲醇、無水乙醇均為分析純(天津富宇化工)；維生素C分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為超純水。

1.2 儀器

GENESYS 10S紫外可見分光光度計(美國Thermo Scientific 公司)；BSA124S分析天平(美國Sartorius 公司)；Waters e2695液相色譜儀(美國Waters公司)。

2 實驗方法

2.1 功勞木生物堿成分提取分離

功勞木2 kg，粉碎，95%乙醇回流提取3次，時間分別為2、2、3 h，趁熱抽濾。合并3次濾液，減壓蒸發至無醇味，加鹽酸調節pH為3，石油醚萃取3次除去脂溶性成分，剩余水層加稀氨水緩慢調節pH為9，靜置，過濾得沉淀10.6 g，即為所需生物堿總樣，放置冰箱冷藏保存。

利用pH-區帶精制逆流技術，溶劑系統為氯仿：甲醇：水(4：3：3,V/V)，上相加入60 mmol/L鹽酸，下相加入7.5 mmol/L三乙胺，流速2.0 mL/min，分離、鑒定得到小檗堿、藥根堿、巴馬汀、非洲防己堿和千金藤寧堿，純度達95%以上。

2.2 功勞木總生物堿及單體生物堿成分抗氧化活性的測定

2.2.1 繪制標準曲線

準確稱取DPPH 2.5 mg，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，配成濃度為25 μg/mL的標準溶液(現用現配)，分別取0、2、4、6、8、10 mL標準溶液用無水乙醇定容至10 mL，配成濃度分別為0、5、10、15、20、25 μg/mL的標準溶液系列。測定上述6組標準溶液的吸光度，繪制成標準曲線。

2.2.2 DPPH法測定自由基清除率

根據文獻[21-24]稍作修改，精密稱取2.0 mg DPPH，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，得20 μg/mL的DPPH溶液(現用現配)。分別配制功勞木總生物堿0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL，小檗堿0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL，藥根堿0.05、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mg/mL，巴馬汀0.05、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.60 mg/mL，非洲防己堿0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 mg/mL和千金藤寧堿0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mg/mL，作為受試樣品。實驗設置樣品組、對照組和空白組，樣品組取3 mL DPPH溶液加入10 mL比色管中，再加入2 mL受試樣品溶液；對照組取3 mL無水乙醇加入10 mL比色管中，再加入2 mL樣品溶液；空白組取3 mL DPPH溶液加入10 mL比色管中，再加入2 mL無水乙醇。3組均充分混勻，在30 ℃水浴中避光反應30 min，冷卻至室溫，517 nm下測吸光值。每個樣品平行測定3次取平均值，陽性對照為不同濃度(0.78、1.56、3.13、6.25、12.50 μg/mL)的抗壞血酸(維生素C)溶液。

其中，A0為空白組的吸光度值；Ai為樣品組的吸光度值；Aj為對照組的吸光度值。

3 結果與分析

3.1 DPPH標準曲線的繪制

不同濃度DPPH溶液在517 nm下的吸光度標準曲線見圖1。實驗表明，在0～25 μg/mL范圍內DPPH溶液濃度與吸光度呈線性正相關關系。用最小二乘法作線性回歸，得DPPH溶液濃度與吸光度關系曲線的回歸方程式為：A=0.021 7C-0.001 8，相關系數R2= 0.999 7。

圖1 DPPH標準曲線Fig.1 Standard curve of DPPH

3.2 功勞木總生物堿及單體生物堿成分的抗氧化活性測定

功勞木總生物堿及單體生物堿成分自由基清除力見圖2，由此可以看出，功勞木總生物堿及單體生物堿對DPPH均有一定的清除作用，且在測定的濃度范圍內DPPH清除率隨著濃度的增加而增加。總生物堿濃度為0.3 mg/mL時，DPPH清除率達97.29%，具有良好的抗氧化活性。各單體化合物也有較好的抗氧化活性，非洲防己堿在濃度為0.4 mg/mL時，DPPH清除率在83.28%；千金藤寧堿抗氧化活性較差，濃度為2 mg/mL時，DPPH清除率在95.07%。

由表1可以看出，功勞木總生物堿及各單體生物堿成分在測定濃度范圍內，最大濃度達到的自由基清除率。由公式計算得，功勞木總生物堿、小檗堿、藥根堿、巴馬汀、非洲防己堿以及千金藤寧堿的半抑制濃度IC50依次為0.07、0.32、0.24、0.20、0.18、0.59 mg/mL，均低于維生素C的IC50值。其中，總生物堿抗氧化活性高于單體生物堿，非洲防己堿的抗氧化活性高于其他單體生物堿成分。

圖2 功勞木總生物堿及單體生物堿成分對DPPH自由基的清除力Fig.2 DPPH scavenging rates of total alkaloids and five monomeric alkaloids of Caulis Mahoniae

表1 功勞木總生物堿及單體生物堿成分自由基清除率比較Table 1 Comparison of radical scavenging rates of total alkaloids and five monomeric alkaloids of Caulis Mahoniae

4 結論

本文采用DPPH法對功勞木中生物堿成分進行了抗氧化活性研究，測定了功勞木總生物堿及單體生物堿成分的抗氧化活性。實驗結果表明，功勞木總生物堿及單體生物堿成分對DPPH均有消除作用，且隨著樣品濃度增大，消除DPPH的能力增強，清除能力依次為功勞木總生物堿大于非洲防己堿大于巴馬汀大于藥根堿大于小檗堿大于千金藤寧堿。功勞木總生物堿抗氧化活性明顯強于單體生物堿，推測功勞木生物堿抗氧化活性為協同效應，其作用機理有待于進一步地研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015:85.

[2]叢悅, 王艷, 王天曉, 等.功勞木的化學成分研究[J].中成藥, 2011, 33(6):1008-1010.

[3]劉靜. 功勞木和藜蘆化學成分研究及功勞木質量控制研究[D]. 開封：河南大學, 2012.

[4]程軒軒,王冬梅, 楊得坡. 異喹啉類生物堿的生物活性和構效關系研究進展[J].中草藥，2006, 37(12): 1900-1904.

[5] RACKOVA L, OBLOZINSKY M, KOSTALOVA D, et al. Free radical scavenging activity and lipoxygenase inhibition ofMahoniaaquifoliumextract and isoquinoline alkaloids [J]. Journal of inflammation, 2007, 4:15.

[6]邵順波. 異喹啉類生物堿的生理活性及研究進展[J].安徽醫藥. 2007, 11(3):254-255.

[7]劉佳, 劉光明. 天然產物中抗HIV 生物堿類化合物的研究進展[J].現代藥物與臨床,2012, 27(5):519-522.

[8]林琳. 四氫異喹啉類生物堿抗血小板聚集藥物研究進展[J].現代中藥研究與實踐,2014, 28(1):83-86.

[9]李學哲, 樸惠順. 異喹啉類生物堿的抗腫瘤作用及機制的研究進展[J].華西藥學雜志,2014, 29(1):94-97.

[10]趙娜, 高峰, 劉彬, 等. 芐基四氫異喹啉類生物堿的藥理作用及其研究進展[J].藥學實踐雜志,2015, 33(4):313-315.

[11]郭姣梅, 盧國勛, 戴岳. 常見異喹啉類生物堿藥代動力學研究概況[J].亞太傳統醫藥,2013, 9(9):52-53.

[12]李春陽, 許時嬰, 王璋.DPPH法測定葡萄籽原花青素清除自由基的能力[N].食品與生物技術學報. 2006, 25(2):102-106.

[13]李秋紅, 李廷利, 黃莉莉, 等. 中藥抗氧化的作用機理及評價方法研究進展[J]. 時珍國醫國藥. 2008, 19(5):1257-1258.

[14]王和才, 胡秋輝. DPPH法測定紫紅薯提取物清除自由基的能力[J]. 食品研究與開發. 2010, 31(1):132-134.

[15]陳玉霞, 劉建華, 林峰, 等.DPPH和FRAP 法測定41 種中草藥抗氧化活性[J]. 實驗室研究與探索, 2011, 30(6):11-14.

[16]韋獻雅, 殷麗琴, 鐘成, 等. DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J].食品科學. 2014, 35(9):317-321.

[17]梁蓉蓉, 賈振斌, 羅輝, 等. DPPH在抗氧化活性評價中的應用[J].廣東化工. 2014, 41(20):57-58.

[18]PRAKASH D, SINGH B N, UPADHYAY G. Antioxidant and free radical scavenging activities of phenols from onion (Alliumcepa) [J]. Food Chemistry, 2007, 102(4): 1389-1393.

[19]SHARIFIFAR F, MOSHAFI M H, MANSOURI S H, et al. In vitro evaluation of antibacterial and antioxidant activities of the essential oil and methanol extract of endemicZatariamultifloraboiss [J]. Food Control, 2007, 18(7): 800-805.

[20]SCHERER R, GODOY H T. Antioxidant activity index (AAI) by the 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl method [J]. Food Chemistry, 2009, 112(3): 654-658.

[21]高秋萍, 阮紅, 毛童俊, 等.紫心甘薯多糖的抗氧化活性研究[J].營養學報， 2011, 33(1):56-60.

[22]何志超, 王冬梅, 李國成, 等.巖黃連生物堿類成分及其抗氧化活性研究[J].中草藥，2014, 45(11):1526-1531.

[23]邱丹纓, 溫揚敏, 蘇齊, 等.兗州卷柏生物堿的抗氧化活性研究[J].天然產物研究與開發，2015, 27(3):442-445.

[24]孟祥凱, 孔凡剛, 丁菲, 等. DPPH法測定桑籽不同極性部位抗氧化性[J].食品與藥品，2015, 17(4)： 255-258.

Antioxidant activity of alkaloids in Caulis Mahoniae

ZHU Heng1, WEN Lei1, GENG Yan-ling2, WANG Xiao2,JIA Wen-ting2,WANG Dai-jie2*, YAN Yun-hong3

(1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center,Jinan 250014, China; 3. Jinan Ninth High School of Shandong Province, Jinan 250022, China)

∶We determined antioxidant activity of alkaloids in Caulis Mahoniae by DPPH. We isolated berberine, jatrorrhizine, palmatine, columbamine and stepharanine with pH-zone-refining CCC. We also evaluated external antioxidant capability of dominant alkaloids in Caulis Mahoniae through DPPH free radical scavenging rate determination of total alkaloids and monomeric alkaloids. Results show that linear positive correlation exists for the concentration and absorbance of DPPH solution from 0 to 25 μg/mL. IC50of total alkaloids, berberine, jatrorrhizine, palmatine, columbamine and stepharanine are respectively 0.07, 0.32, 0.24, 0.20, 0.18, and 0.59 mg/mL, so alkaloids of Caulis Mahoniae has certain antioxidant capability. It will be enhanced with the increase of alkaloids concentration. Moreover, antioxidant ability of total alkaloids is higher than that of monomeric compounds. Antioxidant activity of Caulis Mahoniae alkaloids may be synergistic effect.

∶Caulis Mahoniae; alkaloids; antioxidant activity

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.004

2016-04-29

國家自然科學基金(21506119)

朱姮(1990—)，碩士研究生，研究方向為天然產物分離與純化。Email：sdzbzdzh@sina.com

*通信作者。Email：wangdaijie@126.com

R284.1

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