用細胞中和法測定單抗效價

摘 要：本研究旨在利用細胞中和實驗方法測定單克隆抗體是否具有中和病毒的活性。利用細胞中和法測定兩株包被（捕獲）單克隆抗體3D7（含O/Mya98/XJ/2010株抗體）和7G3（含O/GX/09-7株抗體）對不同病毒的中和抗體值，驗證這兩株單抗是否具有中和病毒的活性。結果表明：7G3可以中和O/GX/09-7株病毒，但不能中和其他毒株病毒，雖然中和能力不強，但是特異性中和，進一步驗證該抗體僅與O/GX/09-7株反應；3D7僅與緬甸98株發生特異性結合反應，與其他毒株均不產生反應，而且中和效價達1∶128，屬于具有中和能力的單抗抗體。

關鍵詞：單克隆抗體；細胞中和實驗；特異性

中圖分類號：S815 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2017）03-0056-02

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）引起的偶蹄獸的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。該病感染途徑多、傳播速度快，嚴重危害畜牧業的發展和國際經濟貿易的流通，被世界動物衛生組織（OIE）列為A類疾病，該病為必須上報的疾病。我國也將其列為一類傳染病，并列為國家強制性免疫的動物疫病之一[2]。根據口蹄疫血清型不同，口蹄疫病毒分為O、A、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ、AsiaⅠ七個型血清型[3]，且各個血清型間沒有交叉保護力，每個血清型又有很多亞型，型內不同毒株間的變異可導致抗原差異，這為口蹄疫的診斷和預防帶來了極大的困難[4]。

目前FMDV單克隆抗體主要應用于FMDV抗原位點的分析與定位、FMDV受體結合位點的研究、FMDV抗原結構與生物學功能相關性研究、鑒定并跟蹤病毒株抗原變異等方面，同時，FMDV單抗還可以根據流行毒株的中和單抗譜，從疫苗毒株中選擇出相近毒株，應用于免疫預防中。針對疫苗株的單克隆抗體，也可用于對疫苗質量進行評估。

1 材料

1.1 病毒

中和用毒為O/GX/09-7、O/JMS、O/MYA98/BY/2010、O/OZK-93、O/Mya98/XJ/10-11、Re-A/WH/09和Asia1/JSL 7株細胞毒，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.2 單抗

3D7（含O/MYA98/BY/2010株抗體）和7G3（含O/GX/09-7株抗體）抗體，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.3 主要試劑

BHK-21細胞營養液、維持液，由工程實驗室病毒室提供。

2 方法

2.1 單抗的稀釋

在96孔細胞培養板上分別加入單抗，用無血清細胞維持液稀釋單抗，從1∶5開始作一系列倍比稀釋，每孔含量50 μL，每個稀釋度做4個復孔。

2.2 稀釋病毒

取-70 ℃冰箱保存的病毒液，按照測定的毒價作200 TCID50稀釋（與等量單抗混合后，其毒價為100 TCID50）。

2.3 感作

每孔加入50 μL已稀釋好的病毒液，置5% CO2 37 ℃恒溫培養箱，中和1 h。

2.4 加入細胞懸液

單抗與病毒中和1 h后，取出，每孔加入50 μL細胞懸液，置于5%CO2 37 ℃恒溫培養箱中繼續培養。每隔24 h觀察一次并記錄結果。

2.5 病毒回歸實驗

先將病毒作0.1、1、10、100 TCID50稀釋，每個稀釋度做4個復孔，每孔含量100 μL。然后每孔加入100 μL細胞懸液，置5%CO237 ℃恒溫培養箱培養。判定結果時0.1 TCID50應無病變，1 TCID50應有1～3孔病變，100 TCID50全都病變，表明實驗成立，否則需要重做。

2.6 正常細胞對照

為避免培養板本身引起實驗誤差，應在每塊實驗板上均設立4孔不接種病毒和單抗的的正常細胞對照，該對照應在整個實驗中一直保持良好的形態。

2.7 結果判定和計算

當病毒回歸實驗、正常細胞對照全部成立時，才能進行判定。被檢單抗孔出現100%病變判為陰性，50%以上細胞出現保護者為陽性；固定病毒稀釋單抗中和實驗的結果計算，以單抗/病毒混合物的50%終點表示單抗的最終稀釋度，按Karber法計算50%單抗中和滴度。

3 實驗結果

實驗結果見表1。

4 結論

實驗結果表明，7G3僅中和O/GX/09-7株細胞毒，而不中和其他毒株；3D7僅中和緬甸98株，而不能中和其他毒株。結果表明2株建立ELISA方法的關鍵抗體捕獲抗體，一株3D7是強中和性單克隆抗體，一株7G3為弱中和性單克隆抗體，但進一步驗證了2株抗體均有很強的特異性。

參考文獻：（2篇，略）