探討生化分析中化學發光的應用

（淮南師范學院，安徽 淮南 232000）

【摘要】：化學發光分析方法是一種根據發光反應對化學發光物質由激發態躍遷回基態時所發出的光信號盡心測量的方法。這種方法具有操作便捷、分析速度快、智能化的實現性高以及結果較精確等優勢。化學發光在醫療等領域有較為廣泛的應用。本文主要對化學發光技術在DNA、生物酶、以及蛋白質檢測等等中的應用進行了論述。

【關鍵詞】：生化分析；化學發光；應用

化學發光是一種物質在進行化學反應時發生的光輻射現象。化學發光包括直接和間接發光兩種。從本質上來說，化學發光分析方法主要是根據化學發光反應，對化學發光物質由激發態躍遷回基態時所發出的光信號進行測量的方法。化學發光從魯米諾化學發光試劑的產生到如今，歷經了一百多年的發展，奠定了其在生化分析中的重要地位。

一、化學發光簡介

目前最常用的三個化學發光體系分別為魯米諾-H2O2、四價錳離子和聯吡啶釕電化學發光體系。

1、魯米諾-H2O2

魯米諾是最常用的化學發光劑。最早在20世紀20年代末時，國外學者將H2O2加入到魯米諾堿性溶劑，發現會產生氧化還原反應并有微弱的藍色發光現象。而加入HRP類的催化劑或者氧化劑時，反應強度也會相應增加。DNA酶也具有催化能力，例如氯高鐵血紅素/G-四聯體DNA酶能夠對魯米諾-H2O2反應進行催化，從而產生化學發光。目前DNA酶已經形成了多種化學發光體系并被應用于轉錄因子、金屬離子以及生物酶活性等的檢測。

2、四價錳離子

雖然作為化學發光劑，酸性KMnO4的應用時間和范圍都具有優勢，但四價錳化合物被作為化學發光劑的使用卻較少。固體MnO2首次被作為化學發光劑檢測異煙肼是在20世紀90年代末，但其應用范圍非常有限，原因是MnO2無法溶于水。進入21世紀，國外學者第一次使用Mn4+，將其作為化學發光劑來對嗎啡和可卡因進行檢測。具體來說，是將溶解于H3PO4和甲醛當中的Mn4+作為化學發光劑。

3、聯吡啶釕電化學

ECL也就是電致化學發光是先對電極施加電壓造成電化學反應，繼而引起高能級電子的轉移反應，從而使得化學發光發生。電致化學發光的特點主要包括背景干擾小、發光空間和時間可控等。三價聯吡啶釕是目前應用范圍最廣的電致化學發光劑。聯吡啶釕化合物在穩定性、發光效率等方面具有很大的優勢，而且還可重復激發，并且電化學可逆。但由于其在水中易氧化，不穩定，因此應用范圍受到限制。

二、化學發光與其他技術的聯合應用

由于單一的化學發光分析在抗干擾性等方面存在缺陷，因此一般和其他技術聯合使用。

1、以非擴增技術為基礎的化學發光分析

以非擴增技術為基礎的化學發光分析主要包括以高效液相色譜、毛細管電泳、量子點和微流體芯片以及微陣列為基礎的化學發光分析。高效液相色譜與化學發光分析聯合使用，綜合了二者的優勢，具有高靈敏度和高效率的特點，但不足之處在于動態范圍較窄；毛細管電泳法與高效液相色譜相比，動態范圍變寬，而且能達到分離速度快、分離效果好的結果；量子點法作為新型發光材料，具有量子產率高、光學穩定性好以及寬激發窄發射等優勢；微流體芯片以及微陣列使得化學發光分析的微型化趨勢更加明顯，同時具有攜帶方便、分析成本低以及分析速度快的優勢。

2、以擴增技術為基礎的化學發光分析

將化學發光與核酸擴增技術結合起來使用能夠使檢測結果更精確。等溫擴增是一項以酶促反應為基礎的核算擴增技術。該技術主要包括鏈置換擴增、滾環擴增、等溫指數擴增以及切口酶信號擴增等等。由于等溫擴增的發生對于溫度的要求并不是很高，在反應過程中不需要對溫度進行嚴格控制，因此以擴增技術為基礎的化學發光分析具有擴增流程簡單且時間較短的優勢。

三、化學發光在生化分析中的應用

1、對DNA進行檢測

核酸分析在現代生物科學領域中占據著不可缺少的重要位置。目前使用最廣泛的核酸分析基本上都需要標記技術，例如電化學分析中的二茂鐵以及其他氧化還原標記，還有光學分析中的熒光標記。由于化學發光分析在操作流程、成本等方面有較強的優勢，因此在DNA檢測中被廣泛應用。最常用的例如聯合使用顏色不同的量子點和DNA酶催化的化學發光，以此對多種DNA進行同時檢測。這種檢測方法主要是使用CRET促成量子點發光，使得檢測結果更精確。

2、對生物小分子進行檢測

二硫化物和低分子量硫醇也在細胞的氧化還原反應中起著重要作用。與傳統的樣品處理方法相比，HPLC和Mn（IV）化合物介導的化學發光克服了分析物降解或者氧化的弊端，提高了檢測結果的精確度。具體來說，二者結合能夠對血液中的CSH和GSSG進行快速檢測。部分學者設計了兩條DNA，一條含有DNA酶序列，另一條含有抗ATP適配體序列，并在ATP檢測過程中將基于DNA酶催化的化學發光共振能量進行利用。在ATP存在的情況下，就會形成穩定的G-四聯體結構，從而生成化學發光。

3、對生物酶活性進行檢測

以往的端粒重復序列擴增技術在檢測端粒酶方面具有耗時長以及檢測流程繁瑣的缺陷，因此將化學發光與兩級等溫擴增相結合，免去了分離和洗滌的環節使得檢測時間更短、操作更靈活，而且檢測結果更靈敏，結果更精確。此外，還有一種能使引發指數擴增的方式，那就是利用DNA甲基化轉移酶。設計具有一定規則的環狀DNA模板，在DNA甲基化轉移酶存在時能夠使得指數擴增并產生大量的DNA酶，從而產生化學發光信號。

4、對蛋白質進行檢測

轉錄因子是一種與糖尿病、癌癥等疾病關系較為密切的DNA結合蛋白。使用化學發光與等溫指數擴增相結合的方法，對轉錄因子NF-kB p50進行超靈敏檢測。同時使用轉錄因子和探針，能夠使外切酶III不發生切割，然后在T7 RNA聚合酶的作用下產生大量RNA引物，并使等溫指數擴增，DNA酶順勢產生，從而促使化學發光的發生。

5、對金屬離子進行檢測

對金屬離子進行檢測的最典型表現為將化學發光應用于Hg2+的檢測。設計兩個分別包含DNA酶亞基I和II以及胸腺嘧啶識別位點的亞基III和IV的DNA探針。胸腺嘧啶位點的作用是對Hg2+進行識別，亞基III和IV中含有部分互補序列。Hg2+能使得亞基III和IV形成T-Hg2+-T復合物，從而兩個探針自動形成穩定G-四聯體，并催化產生魯米諾-H2O2化學發光。

結束語：

化學發光分析在檢測方面具有耗時短、成本低、檢測效率高以及檢測結果精確的優勢，因此在很多領域尤其是醫學和環境監測方面得到了廣泛應用。尤其是在毛細管電泳、等溫擴增等技術與化學發光相結合之后，化學發光技術克服了以往技術中存在的抗干擾能力差等缺陷，檢測方式更便捷，檢測過程更容易，因此其應用前景更加光明。

參考文獻：

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