C57BL/6品系小鼠精子冷凍保護劑的選擇

摘要：遺傳工程技術(shù)的快速發(fā)展，遺傳修飾小鼠的獲得越來越容易，如何高質(zhì)量保存這些小鼠資源已經(jīng)成為一個重要的問題。精子冷凍保存是指將精子保存于超低溫狀態(tài)下，使精子新陳代謝速度減慢或停止，一旦恢復正常生理溫度又能繼續(xù)發(fā)育的過程。小鼠精子冷凍保種法由于其操作簡單、經(jīng)濟、并且產(chǎn)生后代的潛在能力強，已經(jīng)在國外很多實驗動物中心廣泛使用，但國內(nèi)動物中心普遍還是采用傳統(tǒng)的小鼠活體保種法。由于活體保種法非常不經(jīng)濟，又存在種源動物易污染，珍貴品系易丟失等潛在風險。鑒于目前遺傳修飾小鼠大部分是C57BL/6品系背景的，因此，建立和健全完善的C57BL/6品系小鼠精子凍存保種系統(tǒng)迫在眉睫。本文通過對比三種不同的精子凍存保護劑，找出適合C57BL/6品系小鼠的精子凍存保護劑。

關(guān)鍵詞：C57BL/6品系；精子凍存；冷凍保護劑

中圖分類號：Q 7 文獻標識碼：A

1 遺傳修飾小鼠的獲得現(xiàn)狀

作為常用的模式生物之一，小鼠在現(xiàn)代生物醫(yī)學研究中發(fā)揮著不可或缺的作用。隨著遺傳工程技術(shù)的快速發(fā)展，遺傳修飾小鼠的獲得越來越容易，如何高質(zhì)量保存這些小鼠資源已經(jīng)成為一個重要的問題，建立和健全完善的小鼠保種體系是生物醫(yī)學發(fā)展的迫切需求。小鼠保種方法主要有活體保種、胚胎冷凍、卵母細胞冷凍、精子冷凍、精子凍干等。目前國際上比較常用的是胚胎冷凍和精子冷凍[1-2]。但由于小鼠精子有較大的鐮刀狀頭部和較長的尾部，對冷凍造成的機械損傷非常敏感，同時小鼠精子質(zhì)膜成分特殊導致其對冷凍滲透壓耐受性低[3-4]，所以小鼠精子冷凍完后成活率與復蘇率非常低。直到Nakagata發(fā)明的“Nakagata冷凍法”）[5-8]。盡管Nakagata冷凍法對于部分小鼠品系的精液的冷凍保存具有很好的效果，但對于實驗室廣泛使用的C57BL/6、BALB/C等近交系小鼠的精子用Nakagata冷凍法凍完后的成活率和受精率遠遠低于封閉群和雜交小鼠[3，9]。C57BL/6等實驗室常用近交系小鼠的精子冷凍已成為當前急劇增加的遺傳工程小鼠保種的一個瓶頸，同時也是國內(nèi)外研究的熱點。因此，建立和優(yōu)化適用于C57BL/6等近交系的小鼠精子凍存技術(shù)是生物醫(yī)學科研發(fā)展的迫切需求。我們以Nakagata冷凍法為基礎(chǔ)，參考《小鼠胚胎操作手冊-第三版》、日本熊本大學CARD中心，同時查閱文獻找到了以下三種凍存液，利用這三種凍存液進行對比，希望能找到適合C57BL/6品系小鼠精子的凍存液。

三種凍存液配方如下：Buffer 1：18%棉子糖，3%脫脂奶粉，水浴溶解，13000g離心15 min，0.22 μml濾器過濾后，于-20℃保存。Buffer 2：18%棉子糖，3%脫脂奶粉，水浴溶解，13000g離心15 min，0.22 μml濾器過濾，于-20℃保存。用前加0.004%硫代甘油。Buffer3：18%棉子糖，3%脫脂奶粉，1.46% L-谷氨酰胺，水浴溶解，13000g離心15 min，0.22 μml濾器過濾后，于-20℃保存。

2 結(jié)果

我們利用三種不同凍存液（Buffer1、Buffer2、Buffer3）對C57BL/6品系，16周齡的雄鼠進行精子快速冷凍。三個月后，將小鼠精子復蘇后進行體外受精，第二天統(tǒng)計二細胞胚胎數(shù)目所占的比例指示體外受精效率（IVF Rate）進行統(tǒng)計比較，如圖一所示，Buffer 2的效果最好，平均受精效率接近60%，已經(jīng)達到國際先進水平。而Buffer 1和Buffer 3效果都不太理想。

另外，我們還用Buffer 2對FVB品系和BALB/C品系小鼠精子進行冷凍，F(xiàn)VB品系精子復蘇后體外受精效率可以高達90%以上，而BALB/C品系小鼠精子復蘇后平均體外受精效率也在50%以上。

Buffer 2是我們通過查閱文獻在基礎(chǔ)凍存液基礎(chǔ)上加了0.004%硫代甘油的，綜上所述，Buffer2是一種適用于好幾種近交品系的優(yōu)秀的精子凍存液。另外，分別有研究報道在凍存液中添加自由基清除劑、膽固醇、環(huán)化糊精、表面活性劑、抗凍蛋白等都能在一定程度提高小鼠精子的抗凍能力，接下來，我們還可以對該凍存液進行進一步優(yōu)化。

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