胃賁門癌組織中卵泡刺激素及其受體的分布研究

摘要：目的 研究胃癌組織中卵泡刺激素（FSH）及其受體（FSHR）的分布情況及其意義。方法 運用免疫熒光法檢測58胃賁門腺癌組織中FSH和FSHR的分布。結果 FSH和FSHR在高分化胃賁門腺癌組織中的表達陽性率分別為69.2%和69.2%，在中分化胃賁門腺癌組織中的表達陽性率分別為37.8%和48.1%，在低分化胃賁門腺癌組織中的表達陽性率分別為27.8%和22.2%。胃賁門腺癌組織中FSH和FSHR表達水平具有相關性（r=0.463，P<0.05）。結論 FSH和FSHR均存在分布于胃賁門腺癌組織中，且分布水平同組織分化程度密切相關，FSH和FSHR分布可能與胃賁門腺癌的生物學行為相關。

關鍵詞：卵泡刺激素；卵泡刺激素受體；免疫熒光；胃賁門腺癌

Abstract：Objective To study the distribution and its significance of follicle stimulating hormone （FSH） and it's receptor （FSHR） in human gastric cardia adenocarcinoma. Methods Immunofluorescence histochemical staining and confocal laser scanning microscope were used in in 58 samples .Results The positive rates of FSH and it's receptor were 69.2% and 69.2% in well differentiated gastric cardia adenocarcinoma， 37.8% and 48.1% in moderately differentiated gastric cardia adenocarcinoma， 27.8% and 22.2% in poorly differentiated gastric cardia adenocarcinoma respectively. Significant correlation was found between the distribution of FSH and it'sreceptor and their differentiation grade in gastric cardia adenocarcinoma tissues （r=0.463，P<0.05）. Conclusion Distributed in the gastric cardia adenocarcinoma tissue there were FSH and FSHR， and the horizontal distribution is closely related with differentiation degree， FSH and FSHR distribution may be associated with biological behavior of gastric cardia adenocarcinoma.

Key words：Follicle stimulating hormone（FSH）； Follicle stimulating hormone receptor（FSHR）； Gastric carcinoma； Immunohistochemistry

胃癌是源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，主要是胃腺癌，其次為未分化癌，是消化系統中最常見的惡性腫瘤之一，一經發現多為進展期，常伴有區域淋巴結轉移或遠處組織器官轉移，其死亡率高[1]。胃癌中雌激素及其受體的研究可以追溯到上個世紀，但一直沒有突破性的進展[2]。有文獻報道，約40%～60%的人類癌癥的發生與內源性或外源性的性激素作用有關[3]目前已知與性激素有關的腫瘤有乳腺癌、前列腺癌、肝癌等，但有關性激素與胃癌關系的研究并不多見。為此，我們進行了有關胃癌組織中卵泡刺激素及其受體的定位分布實驗，目的是為探討卵泡刺激素在胃癌發生發展中的關系及其臨床病理學改變提供形態學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2009年1月～2013年7月我院經手術和病理證實的58例胃癌患者的石蠟病理標本組織，年齡43～76歲，平均48.6歲。參考世界衛生組織（WHO）消化系統腫瘤分類，其中高分化17例，中分化22例，低分化19例。所有患者均為第1次手術，且術前未接受任何形式的放療和化療。另選58例腫塊旁正常胃組織作對照。

1.2 實驗試劑及用品

1.2.1試劑 FITC山羊抗小鼠及TRITC山羊抗兔均為北京鼎國公司提供。兔抗FSH抗體及羊抗FSHR抗體為SANTA公司提供。BAS及APES購自華美生物工程公司。

1.2.2器械 電熱恒溫培養箱DNP-9162上海精宏實驗設備有限公司，恒溫水浴鍋HWS12上海一恒科技有限公司，石蠟切片機SYD-S2010沈陽譽德電子儀器有限公司，顯微鏡（BX43）為奧林巴斯產品，攝像裝置（Moticam Pro 252）及成像軟件系統（Motic Images PFSus 2.0）為麥克奧斯公司產品。

1.3實驗方法 免疫熒光組織化學雙標記染色：所有實驗病理標本均為4%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片。并按下列程序進行操作：①組織脫蠟和水化：二甲苯中分別浸泡8 min，5 min；梯度乙醇脫水（100%、95%、90%、75%和50%各5 min）；純水中浸泡5 min；PBS浸洗5 min；②抗原修復：檸檬酸鈉抗原修復液微波修復10 min。PBS洗5 min×3次；③血清封閉：擦去組織上多余的水分并向組織上滴加山羊血清，室溫封閉30 min；④一抗孵育：甩去組織上的血清，分別滴加由抗體稀釋液配制的FSH/FSHR抗體，濃度分別為1∶50和1∶200，4℃孵育過夜。PBS洗5min×3次；⑤二抗孵育：?擦去組織周圍多余的水分，滴加TRITC（1∶50）標記山羊抗兔工作液，室溫30 min。PBS洗5 min×3次；?擦去組織周圍多余的水分，滴加FITC（1：50）標記的山羊抗小鼠工作液，室溫30 min。PBS洗5 min×3次；⑥使用甘油-TBS封片劑封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照，使用試劑公司提供的陽性片作為陽性對照。

1.4激光共聚焦掃描顯微鏡（CFSSM）觀察 用CFSSM（OFSympus FV300）觀察。物鏡分別為×10（數值孔徑0.4）和×20（數值孔徑0.7）。FITC488和Cy3548圖像分別從雙重激發的488 nm和548 nm波長獲取，而在其他波長只有很少信號。適當調節FITC488和Cy3548信號能夠保持最佳的實驗條件，使FITC488和Cy3548圖像在同一焦點平面上準確排列。

2 結果

2.1結果判定標準 FSH免疫熒光蛋白陽性染色為綠色顆粒，定位于胞漿中，FSH免疫熒光蛋白陽性染色為紅色顆粒，定位于胞漿中，FSH+FSHR免疫熒光雙標定位于胞漿中，細胞核均無熒光反應物質存在。根據陽性細胞數和染色強度。陽性細胞數<5%為陰性，≥5%～25%計1分，≥25%～50%計2分，≥50%～75%計3分，≥75%計4分；陽性強度以淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分；二者分別相乘，1～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

2.2卵泡刺激素及其受體在胃賁門腺癌組織中的表達主要定位于胞漿中，FSH熒光陽性染色為綠色，見圖1，圖4。FSHR熒光陽性陽性染色為紅色，見圖2，圖5，一些胃賁門腺癌組織細胞既呈FSH又呈FSHR反應陽性，呈黃色或紅綠相間熒光，見圖3，圖6。圖7-9為該病變組織HE染色。

在58例胃賁門腺癌組織中，FSH、FSHR 的陽性表達率隨著腫瘤分化程度的降低而降低，見表1，由表1可見，FSH和FSHR 陽性表達率低分化癌顯著低于高分化癌，三組之間差異有統計學意義（χ2=7.025，P<0.05；χ2=8.021，P<0.05）。

2.3胃賁門腺癌組織中卵泡刺激素及其受體表達之間的關系采用Spearman 等級相關分析表明，胃賁門腺癌組織中FSH與FSHR 表達呈正相關（r=0.406，P<0.01），見表2。

2.4統計學方法 采用SPSS 13.0 軟件進行統計分析，采用χ2檢驗，運用Spearman 等級相關對FSH和FSHR的表達相關性進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 討論

卵泡刺激素（FSH）是垂體分泌的兩種重要的促性腺激素之一，正常生理狀況下通過結合卵巢組織上皮細胞膜上的卵泡刺激素受體（FSHR）發揮其主要生理作用，調節生殖功能。有文獻報道FSHR和FSHR 存在于下丘腦-垂體-性腺軸以外的組織中[4]，近期的研究發現卵泡刺激素及其受體可存在于胃壁細胞[5]，大鼠的胰腺[6]及大鼠的下頜下腺[7]等正常消化器官。體外研究表明，FSH能明顯誘導兔、老鼠卵巢上皮細胞的增殖，并抑制卵巢癌細胞的凋亡[8]。有學者發現，在胃癌發生過程中，FSH 可增強腫瘤細胞的侵襲性[9]。新近有文獻報道，FSH和FSHR 可存在于一些惡性腫瘤中，FSH能夠通過其受體促進這類腫瘤細胞的MMP-2和MMP-9的表達和活性，從而提高腫瘤的侵襲與增殖能力[10]。

筆者采用免疫熒光定位方法，發現FSH及其受體在胃賁門腺癌組織中均有表達， 二者的定位位于細胞質，且FSH及其受體在胃賁門腺癌組織中的表達水平與腫瘤分化程度密切相關。腫瘤分化越好，二者表達水平越高；反之，腫瘤分化越差，二者表達水平越低，差異有統計學意義。FSH及其受體在胃癌組織中分布的具體意義目前尚不清楚，可能與腫瘤的激素依賴性相關。FSH 和FSHR的表達在本次的實驗中表現出一致性，提示二者在胃賁門腺癌組織中的表達具有一定的相關性，但二者的表達數量上有一定的差異，可能說明賁門癌組織中FSH通過自分泌或旁分泌來對腫瘤細胞的代謝起調節作用。有文獻報道，FSH與受體結合后，①能夠活化芳香化酶，②可以誘導FSH受體形成，其中機制仍需進一步研 究[11]，這也為筆者的實驗提供了一個比較好的解釋。FSH和FSHR在胃賁門腺癌組織中的表達相關性為進一步研究胃癌發病機制及其與內分泌激素之間的關系提供了形態學證據，將來還有可能為胃癌的內分泌治療方案提供更好的參考依據。

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