siRNA沉默LAT2對RASFs侵襲的影響

摘要：本文主要采用實時定量PCR法檢測LATs（L-type amino acid transporters，LATs）家族成員在類風濕患者滑膜組織中的表達。利用人工合成的siRNA沉默LAT2基因，采用實時定量PCR法檢測LAT2的沉默效率，采用 Transwell法檢測沉默LAT2后對RASFs侵襲的影響。實驗結果顯示在類風濕滑膜組織中表達的LATs家族成員主要有LAT1、LAT2和LAT3，其中LAT2的表達明顯高于LAT1和LAT3，在有效下調LAT2（P<0.01）后發現與陰性對照組（NC對照組）相比細胞的侵襲能力明顯下調（P<0.01）。

關鍵詞：siRNA；LAT2；類風濕滑膜成纖維細胞；侵襲

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節滑膜炎癥為主要特征的自身免疫系統疾病。其主要的病理特征為滑膜細胞異常增殖和炎性細胞侵潤，侵襲軟骨，破壞骨組織，嚴重時可致殘[1]。目前RA已成為危害人類健康的重要疾病之一，但其病因尚不清楚。已有研究證實，RA成纖維樣滑膜細胞（rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes， RASFs）作為RA的主要效應細胞，在RA的發病過程中發揮著重要作用[2～4]。并且在發病過程中RASFs表現為過度增殖、凋亡不足、炎性因子分泌過多等生物學特征[5，6]，但其具體機制尚需探索。

LAT2 （L-type amino acid transporter2，LAT2）是一種非Na+依賴的氨基酸轉運載體，存在于細胞膜表面，與4F2的重鏈共價連接發揮生物學功能[7～9]。有文獻報道，LAT2主要表達于小腸、腎臟、大腦、胎盤、卵巢、睪丸、骨骼肌和胰腺[10]。細胞的增殖分化離不開氨基酸，而LAT2作為氨基酸轉運載體在異常增殖和侵襲的RASFs中發揮重要的作用。但目前LAT2在RASFs中仍未見相關報道。本研究通過對RASFs中高表達的LAT2進行有效下調，探究其對細胞侵襲的影響，以期能夠加深對RA發病機制的了解。

1 材料與方法

1.1主要試劑 高糖DMEM培養基、胰蛋白酶購于美國Corning公司；胎牛血清、Ⅱ型膠原酶購于美國Gibco公司； MTS購于美國Promega公司；HiPerFect轉染試劑購于德國Qiagen公司；TRIzol Reagant 購于美國Invitrogen公司；SYBR Green 購于德國Roche公司； Transwell小室購于美國BD（Becton， Dickinson and Company）公司。

1.2主要儀器 LightCycler480 Thermocycler購于德國羅氏公司；PCR Thermal Cycler購于日本TakaRa公司；倒置顯微鏡購于日本Nikon公司Synergy HT酶標儀購于美國Bio Tek公司。

1.3原代細胞培養 本文所有樣本來自山東省立醫院，所有樣品均經患者知情并同意，并經山東省立醫院院倫理委員會通過。RA患者膝關節滑膜組織用Hank's平衡鹽溶液沖洗5～10次，將組織充分剪碎分裝于培養皿中，加入4ml DMEM培養基和120μL二型膠原酶，37℃，6h。消化充分后加入3mL無EDTA的胰酶，進行吹打、消化、過篩。過篩后的細胞懸液收集與離心管中，1500r/min，離心5min。棄上清液，沉渣混勻培養至 37℃、5% CO2培養箱內培養。

1.4采用Trizol法提取細胞或組織中的RNA 向組織或者細胞中加入Trizol反復吹打均勻；再加入氯仿（每500μL Trizol加入200μL氯仿），劇烈震蕩15s，4℃靜置15min，12000r/min，4℃離心15min，取上清于1.5ml離心管中，加入異丙醇250μL，震蕩15s，4℃靜置10min。12000r/min，4℃離心10min，棄上清，加入500mL無水乙醇混勻，洗滌RNA。12000r/min，4℃離心5min，棄上清，室溫干燥5～10min。

1.5采用實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達 ①根據Solabio反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。②反應體系（10μL）：5μL上樣緩沖液，1μL上游引物，1μL下游引物，1μLcDNA，2μL去離子水。反應條件：95℃預變性5min；95℃變性10s，60℃退火10s ，45個循環；72℃延伸10s。mRNA 相對表達量采用比較閾值周期（Ct）方法分析。以GAPDH為內參進行標準化。

1.6細胞瞬時轉染 將RASFs以2×105個/孔接種于12孔板中。根據HiPerFect轉染試劑說明書進行瞬時轉染，實驗分為3個干擾組和陰性對照組（NC對照組）。在24、48h收集細胞。先將siRNA和HiPerFect轉染試劑在200μL高糖DMEM培養基中混合10min，以便形成siRNA-HiPerFect復合物，加至含有細胞懸液的12孔板內。

1.7采用Transwell法檢測細胞侵襲能力 RASFs以（5～10）×104個/孔接種于Transwell的小室內室，外室加入500μL高糖DMEM培養基，37℃、5%CO2，24h后換成高糖DMEM培養基（1%的青鏈霉素混合液）進行饑餓，37℃、5%CO2培養8h。將小室外室換成高糖DMEN培養基（20%胎牛血清和1%的青鏈霉素混合液），37℃、5%CO2培養24h。棄小室內室培養基，外室換成4%多聚甲醛，室溫固定1h，固定結束后將下室換成瑞氏-姬姆薩復合染液500μL（A液與B液1：6混合）染色24h，制片。鏡下隨意取5個視野，細胞計數并比較。

1.8統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件，所得數據以均數±標準差（x±s）表示。兩樣本比較采用t檢驗分析。*P<0.05為差異顯著，**P<0.01，***P<0.001為差異極顯著。

2 結果

2.1 LATs在滑膜組織中的表達 滑膜組織中主要有LAT1、LAT2和LAT3 3個LATs家族成員表達，其中LAT2的表達水平明顯高于LAT1和LAT3（P<0.001），見圖1。

2.2 siRNA的抑制效率 與NC對照組相比，三組siRNA均可明顯抑制LAT2在mRNA水平的表達。其中siLAT2-2在24h和48h的抑制效率最為顯著，達90%左右，見圖2。以下實驗將選取此干擾組繼續實驗。

2.3 siRNA下調LAT2后對RASFs侵襲的影響 與NC對照組相比，siLAT2-2組穿過小室的細胞數明顯減少。顯微鏡下任取5個視野，對穿膜細胞計數發現，siLAT2-2組與陰性對照組相比差異有統計學意義（P<0.01），見圖3。

3 討論

大量實驗證實，RASFs在RA的發病過程中發揮重要的作用。RA的病理特征為滑膜細胞增生和炎性細胞侵潤，而異常增生的細胞必然需要大量的營養物質和氨基酸，由此推測，氨基酸的轉運載體在這一過程中可能發揮重要的作用。本研究通過對RA患者的滑膜組織檢測發現，在RA患者的滑膜組織中主要有LAT1、LAT2和LAT3的表達，其中LAT2的表達明顯高于LAT1和LAT3。由此推測LAT2可能對RA滑膜組織中氨基酸的轉運以及細胞的增值侵襲等起重要的作用。氨基酸的異常吸收和代謝往往與疾病的發生密切相關[8]，并且已有文獻證實，類風濕患者的氨基酸代謝和吸收異常[7]。因此推測作為氨基酸轉運載體LAT2可能對RASFs侵襲密切相關。

目前對LAT2的研究已經應用于臨床，并且具有廣闊的治療前景。它可以識別并轉運甲狀腺激素，利用LAT2轉運氨基酸的特性可以與左旋多巴結合穿過血胎屏障和血腦屏障到達病灶[7]。本文首次探索LAT2的高表達本身可能是RA 的致病原因之一，期望通過對LAT2的探索加深對RA治病機制的了解，并提供一種潛在的治療途徑。本研究結果顯示，下調LAT2的表達后RASFs的侵襲能力明顯降低。這也為治療滑膜細胞侵襲軟骨、破壞骨組織提供一種新的潛在的途徑。

參考文獻：

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編輯/安樺