miR—150促進鼻咽癌細胞放療抵抗

摘要：目的 探討miR-150介導鼻咽癌放療抵抗，揭示miR-150作為癌基因作用。方法 Real-time PCR檢測miR-150在鼻咽癌細胞系中的含量；將miR-150 模擬物轉染CNE-2，miR-150 抑制劑轉染CNE-2R，采用MTS檢測其對CNE-2細胞生長的影響。結果 miR-150在CNE-2R 細胞中表達上調。特異性miR-150抑制劑具有逆轉CNE-2R細胞的輻射抗性作用，而轉染miR-150 模擬物可增強CNE- 2細胞的輻射抗性。過表達miR-150可促進鼻咽癌細胞的生長。結論 miR-150參與了鼻咽癌細胞的放射抵抗，miR-150可能成為一種新的用于合理治療鼻咽癌的治療策略。

關鍵詞：鼻咽癌；放療抵抗；miR-150

鼻咽癌是一種具有較強局部侵襲力以及早期轉移特點的惡性腫瘤。由于其解剖位置特殊且對放射線較為敏感，放射治療是鼻咽癌最重要的治療方法。然而，放療抵抗仍然是鼻咽癌治療中的一大難題[1]。MicroRNA（miRNA）是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，作為一種重要的轉錄后調控因子廣泛參與了腫瘤發生發展的過程。在多種腫瘤中均伴隨有miRNA表達的失調，一些miRNA家族顯示出類似癌基因或抑癌基因的功能。研究腫瘤相關miRNA的切入點一般是通過高通量的芯片篩選。迄今為止，僅有兩個獨立實驗組對鼻咽癌組織進行了miRNA分子差異表達譜分析，分別發現了9個和35個在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中差異表達的miRNA，其中有3個miRNA 分子具有共同變化趨勢：miRNA 29c、miRNA 34b和miRNA 34c。與正常對照鼻咽上皮相比，miRNA-29c在鼻咽癌中下調3～5倍。目前對miR-150在鼻咽癌發生發展中的研究尚無人涉足[2]。尤其在鼻咽癌輻射抵抗中所發揮的作用至今鮮有報道。

本文通過將抗輻射的鼻咽癌細胞株CNE-2R與CNE-2對比發現，miR-150在CNE-2R中表達上調，過表達miR-150可抑制鼻咽癌細胞的生長，該研究結果表明miR-150是評估鼻咽癌放療敏感性的潛在生物標志物，將有助于合理制定鼻咽癌治療策略。

1 材料與方法

1.1主要材料 miR-150 模擬物及scramble購自Ambion公司。

1.2建立CNE-2R與細胞培養 建立放射抵抗的鼻咽癌細胞亞系CNE-2R。取指數生長期的鼻咽癌CNE-2細胞株，予以依次遞增的放療劑量1Gy，2Gy，4Gy，6Gy和8Gy照射，每個劑量至少照射三次，直到細胞增殖到80%再進行下一個劑量的照射，該階段共12個月。

1.3 MTS法檢測細胞增殖活性 采用MTS法檢測細胞增殖，根據CellTiter 96R〇AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒（Promega公司）說明書方法對細胞增殖進行檢測。

1.4 Real-timePCR檢測 取適量細胞，提取用試劑盒（OMEGA Bio-Tek）提取純化miRNA，并利用miScript II RT Kit（QIAGEN）逆轉錄合成cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒（QIAGEN）說明書進行Real-time PCR。研究miR-150含量時，選取RUN6作為內參。提取總RNA，實驗獨立重復三次。

1.5細胞轉染 用胰蛋白酶對細胞進行消化，將細胞計數并接種在6孔板中，確保在轉染當天，70%的細胞匯合。使用Lipofectamine2000（Invitrogen）將濃度均為100nM的miR-150 模擬物，miR-150抑制劑以及相應對照物轉染至細胞。在轉染36h后，進行后續的實驗。

1.6統計學處理 采用SPSS 11.0軟件進行統計學分析。所有結果均以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，當P<0.05時，為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-150與CNE-2R細胞放射抗性相關 qRT-PCR檢測結果顯示miR-150在CNE-2R細胞系中的表達比在CNE-2細胞系中高出。在CNE-2R和CNE-2細胞系中分別進行miR-150過表達與干擾的研究。運用特異性miR-150抑制劑抑制CNE-2R中miR-150的功能以此觀察其生物學特性，通過MTT分析發現，加入特異性miR-150抑制劑后，CNE-2R放射敏感性明顯提高。而在對CNE-2細胞轉染miR-150 模擬物 之后，CNE-2細胞的放射抗性顯著增加。

2.2過表達miR-150可促進鼻咽癌細胞生長 MTS結果顯示，轉染miR-150組鼻咽癌細胞株CNE2細胞的增殖能力在48h、72h、96h后細胞的增殖能力逐漸增強，與對照組比，差異均具有統計學意義（P<0.05）。提示外源高表達miR-150表達均能增強鼻咽癌細胞株CNE2細胞的增殖。

3 討論

鼻咽癌系鼻咽部惡性腫瘤，也是我國最常見的癌腫之一，其發病率有逐年上升的趨勢，嚴重危害著人民健康。鼻咽癌有明顯的地域和種族分布特征，我國南方及東南亞地區鼻咽癌發病率高，歐美地區則少見，僅占全身惡性腫瘤的1%～2%。鼻咽癌發病隱秘，淋巴結轉移發生早，且其發病機制還不十分清楚，治療效果也不理想，5年生存率仍徘徊在50%左右。因此，尋找鼻咽癌早期診斷的特異性分子標志物對于實現鼻咽癌的早期診斷和闡明其發病機制具有深遠意義。腫瘤的化療和放療抵抗是鼻咽癌臨床治療中的主要障礙。目前，盡管已經建立了許多腫瘤化療或放療耐受的細胞模型，且進行了大量的機制研究，但仍然存在許多尚待進一步深入探討的問題。近年來，大量的研究表明miRNA的異常表達在腫瘤的發生、發展以及放化療耐受中起到了重要的作用。miRNA可作為癌癥的重要潛在的預后指標或治療靶點。例如，miR-200b的表達在耐多西他賽的非小細胞肺癌細胞中顯著下調[3]，miR-200可通過調節膀胱癌細胞的上皮-間質轉化過程從而逆轉膀胱癌對EGFR治療抵抗[4]，并且近期研究發現，通過在順鉑耐藥舌癌細胞中重新過表達miR-200b和miR-15b能夠減少BMI1表達使該細胞對化療重新敏感[5]。對于鼻咽癌，放射敏感性是鼻咽癌治療成功與否的關鍵，我們的研究發現miR-150與CNE-2R細胞放射抗性相關，且過表達miR-150可促進鼻咽癌細胞的生長，然而關于miRNA在鼻咽癌放射抗性中的作用仍不清楚，需要更進一步實驗驗證。

參考文獻：

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[2]HC Chen， GH Chen， YH Chen， et al. MicroRNA deregulation and pathway alterations in nasopharyngeal carcinoma[J].British Journal of Cancer， 2009， 100：1002-1011.

[3]Rui W， Bing F， Hai-Zhu S，et al.Identification of microRNA profiles in docetaxel-resistant human non-small cell lung carcinoma cells （SPC-A1） [J].J Cell Mol Med， 2010， 14（1-2）： 206-214.

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編輯/安樺