南艾蒿對幾種田七病原菌的抑制效果試驗

摘要：采用菌絲生長速率法，研究南艾蒿（Artemisia verlotorum Lamotte）乙醇提取物及其萃取物、乙酸乙酯相活性富集片段對田七（Panax notoginseng）主要病害病原菌的抑制作用。結果表明，10 mg/mL的南艾蒿乙醇提取物對田七炭疽病原膠孢炭疽菌（Colletotriehum gloeosporioides）、田七根腐病原茄鐮孢（Fusarium solani）、田七黑斑病原人參鏈格孢（Alternaria panax）的菌絲生長抑制作用明顯，最大抑制率分別為89.66%、74.42%和75.93%；萃取物中乙酸乙酯萃取物對3種病原菌抑制率最大，分別為90.41%、82.68%、71.79%；富集片段F2在10 mg/mL濃度下對3種病原菌菌絲生長抑制率均達到100%。

關鍵詞：南艾蒿（Artemisia verlotorum Lamotte）；田七（Panax notoginseng）；生長速率；抑制率

中圖分類號：S482.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3337-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.017

田七[Panax notoginseng（Burk.）F.H. Chen]，在廣西百色市栽培的為人參屬植物三七，又名金不換，具有活血化瘀、消腫止痛功效，是中國傳統名貴藥材[1]。以田七為主要原料制成的中成藥如云南白藥和片仔癀等廣為流傳。近年來由于田七的連作障礙問題導致病害發生嚴重[2]，防治過程中濫用化學農藥導致田七藥材農藥殘留超標。因此，開發植物源農藥，減少化學農藥使用是解決這一問題的有效途徑。

植物中含有的大多數化學物質如萜烯類、生物堿、類黃酮甾體、酚類等均具有殺蟲和抗菌活性[3]。筆者在調查中發現有田七種植戶噴施艾蒿發酵液用來防治田七病害效果明顯。艾蒿在抑菌、殺菌活性方面的研究已有大量報道[4-6]，具有開發為新型植物源農藥的潛力。目前，利用植物提取物防治田七病害的報道較少。本研究以南艾蒿（Artemisia verlotorum Lamotte）為試驗材料，測定了其乙醇提取物及其萃取物、乙酸乙酯相活性富集片段對田七根腐病原茄鐮孢（Fusarium solani）、田七黑斑病原人參鏈格孢（Alternaria panax）、田七炭疽病原膠孢炭疽菌（Colletotriehum gloeosporioides）3種田七病原菌的抑制作用，為防治田七病害提供農藥用植物源。

1 材料與方法

1.1 材料

植物莖、葉采集于廣西德保縣足榮鄉，經廣西大學農學院馬仲輝博士鑒定為南艾蒿。PDA培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）。

試驗菌株：田七根腐病病原茄鐮孢、田七黑斑病病原人參鏈格孢、田七炭疽病病原膠孢炭疽菌，均由廣西大學農學院植物病理實驗室提供。

試驗儀器：LRH-400-G光照培養箱（韶關市泰宏醫療器械有限公司）、Laborota 4000型旋轉蒸發儀（德國Heidolph儀器公司）、BS110S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）、LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）、DH27-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 南艾蒿乙醇提取物制備 選取無病害南艾蒿鮮莖、葉水洗后自然晾干，粉碎后取8.0 kg用8倍量乙醇于室溫下浸泡4 d，再用4層紗布過濾，得到濾液；濾渣用6倍量乙醇重復上一步浸泡操作，重復2次后，合并3次濾液；濾液減壓、濃縮后得浸膏（889 g）；稱不同量的乙醇提取物浸膏，分別用無菌水定容至10 mL，配制質量濃度為150、75、37.5 mg/mL的南艾蒿乙醇提取物溶液，于4 ℃冰箱保存、備用。

1.2.2 南艾蒿乙醇提取物的萃取 取備用的南艾蒿乙醇提取物，加5倍量無菌水，轉移至分液漏斗中，依次用有機溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3次，各萃取液用旋轉蒸發儀40 ℃減壓、濃縮后得到石油醚相（144.3 g）、乙酸乙酯相（132.9 g）、正丁醇相（132 g）及水相4個部分的萃取相浸膏。稱不同量的各萃取相浸膏，分別用無菌水定容至10 mL（乙酸乙酯相、正丁醇相浸膏先用2 mL丙酮助溶），制得質量濃度為150、75 mg/mL的分級萃取相溶液，4 ℃冰箱保存、備用。

1.2.3 乙酸乙酯相活性富集片段的制備 乙酸乙酯相萃取物經MCI柱，用甲醇水溶液梯度洗脫得到3個片段，F1（50%甲醇洗脫液）、F2（70%甲醇洗脫液）及F3（90%甲醇洗脫液），稱適量的F1、F2及F3部分，蒸發、濃縮后分別用無菌水定容至10 mL（各部分先用2 mL的丙酮助溶），配制質量濃度為150 mg/mL的乙酸乙酯萃取物活性化合物的富集溶液，于4 ℃冰箱保存、備用。

1.2.4 南艾蒿抑菌作用測定 以田七根腐病病原茄鐮孢、田七黑斑病病原人參鏈格孢、田七炭疽病病原膠孢炭疽菌為供試菌株，采用菌絲生長速率法[7]測定抑菌活性。

量取上述備用的乙醇提取物及其萃取物、乙酸乙酯相活性富集片段的不同質量濃度的溶液1 mL，加入融化了的PDA培養基14 mL于90 mm培養皿中制成含藥平板，以等量的無菌水為對照（乙酸乙酯相、正丁醇相及乙酸乙酯相活性富集片段部分以丙酮含量為20%的等量無菌水為對照），待培養基凝固后，在預先培養的病原菌種中用打孔器打取直徑6 mm菌絲塊，轉接到培養皿的中央，每培養皿接種一塊，28 ℃培養，每個供試濃度重復3次。在第48、72、96 h采用十字交叉法測量菌落直徑，取3次重復的平均結果，得到南艾蒿不同濃度提取物對供試菌的抑制效果。按如下公式計算抑菌率：

抑制率=[（對照菌落純生長量-處理菌落純生長量）/對照菌落純生長量]×100%

純生長量=菌落平均直徑-菌餅直徑

1.2.4 數據分析方法 采用IBM SPSS Statistics for Mac 22進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 南艾蒿乙醇提取物對田七病原菌的抑制效果

不同濃度的南艾蒿乙醇提取物對田七3種病原菌的抑制作用見表1。由表1可見，南艾蒿乙醇提取物對田七3種病原菌菌絲生長均有明顯的抑制作用，其中對炭疽病病原菌生長的抑制作用大于根腐病和黑斑病。隨著供試濃度的增加，其抑制率也增加。在培養48 h后，10 mg/mL的南艾蒿提取物對田七炭疽病、根腐病、黑斑病病原菌菌絲生長的最大抑制率分別為89.66%、74.42%和75.93%。但是南艾蒿乙醇提取物對炭疽病和黑斑病病原菌菌絲生長抑制率表現出隨著培養時間延長而降低的趨勢。

2.2 分極萃取物對田七病原菌的抑制效果

為了確認南艾蒿抑菌活性成分的主要極性分布，用各相萃取物來測定抑制作用大小，結果見圖1。由圖1可知，在10 mg/mL供試濃度下培養48 h后，乙酸乙酯萃取物對炭疽病病原菌的抑制作用顯著大于石油醚萃取物、正丁醇萃取物及水相萃取物，最大抑制率達90.41%。對根腐病病原菌，乙酸乙酯萃取物抑制作用顯著大于其余三相萃取物，最大抑制率達到82.68%。對于黑斑病病原菌，乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物的抑制作用顯著大于另外兩相萃取物，其中乙酸乙酯萃取物抑制作用最大，抑制率達到71.79%，但水相萃取物對病原菌有顯著的促進作用。含有20%丙酮的無菌水對田七3種病原菌的抑制作用不明顯。

2.3 乙酸乙酯相活性化合物的富集部分對田七病原菌的抑制效果

根據先前試驗結果選用抑制作用最大的乙酸乙酯相萃取物進一步確立活性富集段，由于其含有葉綠素等可能影響抑菌活性測定的物質，故可利用MCI柱用甲醇水梯度洗脫去除葉綠素后再進行抑菌活性的測定，結果（圖2）表現出在10 mg/mL質量濃度下培養48 h后，F2段對田七3種病原真菌菌絲生長抑制率均達到100%，顯著大于F1、F2段。

3 小結與討論

研究表明，艾蒿植株中的化學成分主要有揮發油類、黃酮類、桉葉烷類和三萜類化合物[8]。江茂生等[9]測定出艾蒿提取物對供試植物病原菌具有不同程度的抑制活性，尤其對水稻紋枯病菌、十字花科菌核病菌、辣椒疫霉病菌、荔枝霜疫霉病菌、柑橘青霉病菌、紅麻灰霉病菌的菌絲生長有較好抑制效果。田七是一種嚴格的陰生植物，在栽培過程中病害發生頻繁。在本試驗中，南艾蒿乙醇提取物對田七3種病原真菌菌絲生長均有很好的抑制作用，且隨著濃度的提高，抑制率呈上升趨勢，對炭疽病病原真菌的抑制效果最好。南艾蒿醇提取物中起抑制作用的活性成分主要分散于石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物中，其中乙酸乙酯段抑制效果更明顯。進一步分離乙酸乙酯萃取物活性得到的富集片段F2，在10 mg/mL質量濃度下對田七3種病原真菌菌絲生長抑制率均達到100%，且在觀察中發現隨著培養時間的延長，抑制效果不變。但若確定具體起作用的化合物活性成分，還需進一步分離純化和活性檢測。本研究表明，南艾蒿中所含物質對田七病原菌有較好的抑制作用，這與田間調查結果一致，這對田七及間套種藥材防治病害具有重要意義。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

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[4] 李曉楠，楊紹斌.復合生物提取物對榆紫葉甲毒殺效果研究[J].湖北農業科學，2014，53（8）：1815-1818.

[5] 徐亞軍.野生艾蒿乙醇浸提物對枯草芽孢桿菌的抑制作用[J]. 湖北農業科學，2012，51（9）：1786-1788.

[6] 江茂生，許文耀.艾蒿提取物對13種植物病原菌物的抑制作用[J].福建農林大學學報（自然科學版），2007，36（4）：352-356.

[7] 肖鳳艷，高郁芳.8種中藥提取物對薏苡灰霉病菌的抑制作用[J].湖北農業科學，2012，51（9）：1784-1788.

[8] 周 峰，秦路平，連佳芳，等.艾葉的化學成分、生物活性和植物資源[J].藥學實踐雜志，2000，18（2）：96-98.

[9] 江茂生，許文耀.艾蒿提取物對13種植物病原菌物的抑制作用[J].福建農林大學學報（自然科學版）.2007，36（4）：352-356.