β—胡蘿卜素代謝調控研究

摘要：研究了酮康唑、β-紫羅蘭酮、表面活性劑和正十二烷對三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）發酵的生物量和β-胡蘿卜素產量的影響。結果表明，酮康唑的最適添加量為30 mg/L，最適添加時間為接種后40 h。β-紫羅蘭酮的最適添加量為0.10%，最適添加時間為接種后36 h。表面活性劑以span-20效果最好，最適添加量為0.10%，接種前加入。正十二烷的最適添加量為1.0%，接種前加入到發酵培養基中。

關鍵詞：β-胡蘿卜素；三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）；代謝調控

中圖分類號：TQ920；O629.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）14-3694-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.038

Abstract： The effect of ketoconazole， β-ionone，surfactant and n-dodecane on the biomass and β-carotene yield of Blakeslea trispora were studied. The optimal addtiton of ketoconazole is 30 mg/L， its optimal adding time is 40 hours after inoculation. The optimal addtiton of β-ionone is 0.10%， its optimal adding time is 36 hours after inoculation. Span-20 is the most effective in the surfactants. Its optimal addtiton is 0.10%. It could be added into the medium before inoculation. The optimal addtiton of n-dodecane is 1.0%. It could also be added into the medium before inoculation.

Key words： β-carotene；Blakeslea trispora；metabolic regulation

β-胡蘿卜素是聯合國糧農組織和世界衛生組織一致認定的A類營養色素，不僅是人體內維生素A的重要來源，且具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、增強免疫等功能，在醫藥、食品著色及營養強化、日用化妝品及飼料添加劑等領域具有廣闊的應用前景[1]。目前，市場上的β-胡蘿卜素產品主要有化學合成品和天然產品兩種類型。天然β-胡蘿卜素因其功能性強、安全性好及生物利用度高等優點而日益受到人們的青睞[2]。發酵法是目前生產天然β-胡蘿卜素的主要途徑。在可合成β-胡蘿卜素的微生物中，三孢布拉氏霉無論是生物量（50 g干菌體/L），還是菌體細胞中β-胡蘿卜素含量（可達菌體干重的1%～5%）都是最理想的，已成為目前國內外研究和生產天然β-胡蘿卜素的主要菌種[3]。本實驗室近年來一直致力于β-胡蘿卜素的發酵制備研究，前期已完成了發酵條件優化[4]、菌種選育[5]以及菌體中β-胡蘿卜素的提取[6]等方面的研究。本研究旨在探索各種代謝促進劑對三孢布拉氏霉合成β-胡蘿卜素的影響，以期進一步提高β-胡蘿卜素的發酵產量，從而為今后的產業化打下一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）正菌是從中國典型培養物保藏中心購買的原種，負菌是從中國典型培養物保藏中心購買的原種經本實驗室誘變選育所得的突變菌株。

1.2 培養基

PDA培養基：新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、自來水1 000 mL， pH自然。

種子培養基：葡萄糖5%、大豆粉1%、1%麩皮浸出液、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4，pH 7.0。

發酵培養基：玉米粉4%、大豆粉1%、1%麩皮浸出液、0.1% KH2PO4、 0.05% MgSO4、0.01% 維生素B1 、1%植物油，pH 7.0。

1.3 菌種活化培養

將保藏的三孢布拉氏霉正、負菌分別接種至新鮮的PDA斜面培養基上，26 ℃培養3 d。

1.4 種子培養

將活化好的三孢布拉氏霉正、負菌分別接種至三角瓶種子培養基中，26 ℃、180 r/m培養36 h。

1.5 發酵培養

將培養好的正、負菌株液體種子（菌絲）分別接種至三角瓶發酵培養基中。接種量為10%，正負菌的接種比例為1∶9，26 ℃、180 r/m發酵培養120 h。在發酵培養的不同時間點加入不同量的代謝促進劑，檢測其對生物量和β-胡蘿卜素產量的影響。

1.6 生物量及β-胡蘿卜素產量的測定

生物量及β-胡蘿卜素產量的測定見參考文獻[5]。

2 結果與分析

2.1 酮康唑對β-胡蘿卜素發酵的影響

唐瓊[7]通過麥角固醇抑制劑酮康唑對三孢布拉氏霉菌異戊二烯合成途徑代謝調控的研究發現，添加適量濃度的酮康唑可促進番茄紅素的產量。由于番茄紅素是類胡蘿卜素進一步合成代謝的分支點，其中一條途徑是在番茄紅素β-環化酶的作用下產生β-胡蘿卜素，故考慮添加酮康唑來研究其對三孢布拉氏霉生物量和β-胡蘿卜素產量的影響。

從圖1可以看出，在接種發酵40 h后加入不同濃度的酮康唑，對生物量沒有太大的影響，說明40 h后三孢布拉氏霉菌絲體基本上都已長好。但對β-胡蘿卜素的產量具有明顯的影響，當酮康唑的添加量為30 mg/L時，β-胡蘿卜素的產量最高，故以該添加量研究不同添加時間對β-胡蘿卜素產量及生物量的影響。

從圖2可以看出，前期加入酮康唑對三孢布拉氏霉菌絲體的生長具有明顯的抑制作用，β-胡蘿卜素的產量也相應較低。36 h后加入對生物量已沒有太大的影響，β-胡蘿卜素的產量也趨于穩定。因此，酮康唑的添加時間以接種發酵40 h為宜。

2.2 β-紫羅蘭酮對β-胡蘿卜素發酵的影響

β-紫羅蘭酮（β-ionone）在結構上與β-胡蘿卜素相似，二者均具有β環，因此最初人們認為β-紫羅蘭酮是β-胡蘿卜素前體，在細胞內可轉化成β-胡蘿卜素。但后來的研究表明，β-紫羅蘭酮的作用是解抑制甲羥戊酸激酶，從而促進β-胡蘿卜素合成[8]。

從圖3可以看出，接種發酵40 h后加入不同濃度的β-紫羅蘭酮時對菌絲體生物量影響不大，而對β-胡蘿卜素產量卻有明顯的影響。當添加0.10% β-紫羅蘭酮時，β-胡蘿卜素產量達到最大，因此，β-紫羅蘭酮添加劑量確定為0.10%。

從圖4可以看出，隨著β-紫羅蘭酮添加時間的推遲，生物量和β-胡蘿卜素產量均有上升趨勢，表明前期菌絲體生長時加入β-紫羅蘭酮對菌絲生長和β-胡蘿卜素合成有抑制作用。接種36 h后添加0.10% β-紫羅蘭酮時β-胡蘿卜素產量達到最大，因此β-紫羅蘭酮添加時間確定為接種后36 h。

2.3 表面活性劑對β-胡蘿卜素發酵的影響

在發酵液中添加適當的表面活性劑，不僅可以改變發酵液的流體特性，增加溶氧，而且可以改變細胞的通透性，增加胞內外物質平衡從而有利于物質傳遞。離子型表面活性劑對細胞具有較強的殺傷作用，一般添加非離子型表面活性劑較好。

從圖5可以看出，接種前在發酵培養基中分別加入0.10%的不同表面活性劑，對三孢布拉氏霉菌絲體的生物量影響不大，但β-胡蘿卜素產量以添加span-20效果最好，故選擇添加span-20表面活性劑。

從圖6可以看出，接種前在發酵培養基中分別加入不同濃度的span-20，當添加濃度低于0.10%時，生物量沒有明顯的影響，當高于0.10%時，生物量略有所下降，說明span-20添加過量，對三孢布拉氏霉菌絲體的生長還是有一定的抑制作用。β-胡蘿卜素產量以0.10%添加濃度時最高。

2.4 氧載體對β-胡蘿卜素發酵的影響

氧載體與發酵液形成的體系具有氧傳遞速度快、能耗低、泡沫生成少、剪切力小等特點，能在不增加能耗的基礎上提高氧傳遞效率，不僅適合于好氧高密度發酵，也適合于溶氧功耗高或因剪切力作用大而難以進行大規模培養的脆弱細胞培養，同時也可應用于固定化生物催化劑好氧反應中[9]。三孢布拉氏霉菌是高好氧菌，因此，利用氧載體提高發酵液中溶氧具有重要的意義[10]。本試驗主要研究了正十二烷對β-胡蘿卜素發酵的影響。

從圖7可以看出，接種前在發酵培養基中分別加入不同濃度的正十二烷，隨著正十二烷濃度的增加，β-胡蘿卜素產量呈先上升后下降趨勢，說明過高濃度的正十二烷不利于菌絲體合成β-胡蘿卜素，1.0%的正十二烷添加到發酵培養基中β-胡蘿卜素產量及生物量均達到最大，因此正十二烷濃度確定為1.0%。

從圖8可以看出，隨著正十二烷添加到發酵培養基中時間的推遲，β-胡蘿卜素產量逐漸降低，表明越早加入正十二烷越有利于提升發酵液溶氧水平從而利于β-胡蘿卜色素合成。正十二烷不同添加時間對菌絲體生長影響不大，因此正十二烷可直接先添加到發酵培養基中。

3 討論

三孢布拉氏霉合成β-胡蘿卜素的途徑已經研究清楚，研究人員為了提高β-胡蘿卜素的產量，在菌種選育及培養基和發酵條件優化方面進行了大量的探索研究，β-胡蘿卜素的產量也得到了不同程度的改善和提高。β-胡蘿卜素的生物合成受合成細胞自身的代謝控制，為了提高其產量，最有效的辦法就是從遺傳的角度打破微生物細胞的正常代謝控制機制。然而，人們目前對內源類胡蘿卜素合成的相關酶基因在生物細胞中如何表達及調控知之有限，這使得在調控類胡蘿卜素生物合成的基因工程研究方面因缺乏理論基礎而帶有一定的盲目性。盡管已有研究者將β-胡蘿卜素合成途徑的關鍵酶基因導入到細菌或酵母菌中，并成功的合成出了β-胡蘿卜素，但由于新的宿主細胞中缺乏三孢布拉氏霉菌絲中所特有的脂溶性油囊結構，使得新宿主細胞承載β-胡蘿卜素的能力有限，因而工程菌合成β-胡蘿卜素的產量依然偏低[11]，現有的β-胡蘿卜素生物合成代謝調控依然以三孢布拉氏霉自身細胞為主。

參考文獻：

[1] 王 雪.β-胡蘿卜素的研究進展[J].中國化工貿易，2013（5）：193.

[2] 13種食品著色劑國家標準初稿完成[J].中國釀造，2010（11）：159.

[3] 張婷婷，葛 佳，牛天貴，等.三孢布拉氏霉菌發酵產β-胡蘿卜素發酵條件的研究[J].食品科技，2009，11（34）：2-7.

[4] 顏作文，王常高，蔡 俊.三孢布拉氏霉菌產β-胡蘿卜素發酵條件的優化[J].食品與發酵科技，2013，49（2）：25-29.

[5] 左 樂，余茜煒，向夢雄，等.β-胡蘿卜素高產菌株的選育[J].湖北農業科學，2014，53（17）：4148-4150.

[6] 余茜煒，向夢雄，左 樂，等.三孢布拉氏霉中β-胡蘿卜素的提取研究[J].安徽農業科學，2014，42（2）：587-588，622.

[7] 唐 瓊.麥角固醇抑制劑酮康唑對三孢布拉氏霉菌異戊二烯合成途徑代謝調控的研究[D].北京：北京工業大學，2009.

[8] 徐軍偉，徐 芳，袁其朋.三孢酸結構類似物對發酵生產番茄紅素的影響[J].北京化工大學學報，2007，34（2）：134-137.

[9] XU F，YUAN Q P，ZHU Y. Improved production of lycopene and β-carotene by Blakeslea trispora with oxygen-vectors[J]. Process Biochem，2007，42（2）：289-293.

[10] KONSTANTINA N，TRIANTAFYLLOS R.Stimulation of the biosynthesis of carotenes by oxidative stress in Blakeslea trispora induced by elevated dissolved oxygen levels in the culture medium[J]. Bioresource Technology，2011，102（17）：8159-8164.

[11] 馮亦平，李 珍，王健梅.工程菌β-胡蘿卜素累積及提取條件優化的研究[J].山西農業科學，2010，38（4）：21-24.