重篩野生黑木耳廢渣中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的研究

摘要：篩選野生黑木耳廢渣中產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的菌株，對(duì)存在的漆酶、錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的活力進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)3種酶的最適溫度和最適pH進(jìn)行考察。結(jié)果表明，在33株野生黑木耳菌株中，得到2株產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶菌株，廢渣中3種酶的平均酶活力分別為54.3、37 200、6.7 U/L；3種酶的最適溫度為28～32 ℃，最適pH為6.2～7.0。廢渣中3種酶活力差別較大，錳過(guò)氧化物酶活力最強(qiáng)，在降解木質(zhì)素上起主要作用，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力最小，作用差。

關(guān)鍵詞：野生黑木耳廢渣；漆酶；錳過(guò)氧化物酶；木質(zhì)素過(guò)氧化物酶；酶活

中圖分類(lèi)號(hào)：Q554.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）17-4510-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.039

Abstract： Bacterial strains which could produce lignin peroxidase were rescreened from the offscum of wild black fungus. Laccase，manganese peroxidase and lignin peroxidase from fungus were determined，optimal temperature and pH were analysed. The results showed that it got two strains which would produce lignin peroxidase from the 33 bacterial strains of wild black fungus，the average activity of three enzymes were 54.3 U/L，37 200 U/L and 6.7 U/L. Optimum temperature and pH of three enzymes were 28 to 32 ℃，6.2 to 7.0. The activity of three enzymes varied greatly. Manganese peroxidase activity was the strongest，played a major role in the degradation of lignin， lignin peroxidase activity was small，had a weak effect.

Key words： the offscum of wild black fungus； laccase； manganese peroxidase； lignin peroxidase； activity

黑木耳是東北大小興安嶺林區(qū)一種常見(jiàn)的食用菌，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，野生黑木耳的產(chǎn)量逐年下降，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，現(xiàn)在市面上的黑木耳多以人工栽培為主。在黑木耳的栽培過(guò)程中，需要用到大量木屑，并且在栽培結(jié)束后會(huì)產(chǎn)生大量廢渣，人們一直在尋找代料栽培，能夠替代木屑的碳源物質(zhì)，以減少對(duì)林業(yè)資源的浪費(fèi)和降低黑木耳栽培的成本，并尋找更好的利用食用菌廢渣中多種有效成分的方法，減輕食用菌栽培對(duì)社會(huì)、環(huán)境等帶來(lái)的諸多問(wèn)題。黑木耳廢渣中含有蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶等在內(nèi)的多種酶，這些酶都是附加值較高的一類(lèi)物質(zhì)，研究者已經(jīng)開(kāi)始對(duì)食用菌廢渣的再處理利用進(jìn)行研究。

木質(zhì)素降解酶是一類(lèi)由白腐菌分泌用于降解植物木質(zhì)素為其提供碳源的酶類(lèi)，主要包括漆酶、錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶3種[1]，多數(shù)微生物只能產(chǎn)生上述酶類(lèi)的一種或兩種，只有少數(shù)菌類(lèi)能產(chǎn)生3種木質(zhì)素降解酶，故3種木質(zhì)素降解酶不是微生物分解木質(zhì)素所必須的，但有研究表明3種木質(zhì)素降解酶在分解木質(zhì)素過(guò)程中各有側(cè)重，一般擁有酶種類(lèi)多的菌種分解木質(zhì)素能力更強(qiáng)[2，3]。黑木耳多產(chǎn)生漆酶和錳過(guò)氧化物酶，而產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶較少見(jiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與廢渣 野生黑木耳菌種37株，標(biāo)號(hào)為T(mén)H1～TH37，均采自黑龍江省伊春市桃山林業(yè)局。

黑木耳廢渣試驗(yàn)前保存于-80 ℃低溫冰箱。

1.1.2 試劑與儀器 Azure B購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。試驗(yàn)所用儀器有HH-601A恒溫水浴鍋、SIGMA 2-16PK冷凍高速離心機(jī)、752型紫外分光光度計(jì)、DNP-9022-1型恒溫培養(yǎng)箱、CLG-32L立式全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 篩選產(chǎn)過(guò)氧化物酶菌種 將采集菌種活化，在每個(gè)長(zhǎng)滿菌絲的活化菌種平板培養(yǎng)基上打3 mm左右孔，制備菌塞，每個(gè)平板制備3個(gè)菌塞；在含有Azure B的固體培養(yǎng)基上3個(gè)3 mm的孔，分別按編號(hào)接種菌塞，將接種好的各亮藍(lán)平板于培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h觀察平板中接種菌落周?chē)欠裼凶兩Γ耘袛嗍欠裼羞^(guò)氧化物酶的產(chǎn)生，有變色圈記為+，無(wú)變色圈記為-[4]，同時(shí)標(biāo)識(shí)顯色時(shí)間。有變色圈的在第7天記錄菌絲圈和變色圈直徑。

1.2.2 黑木耳栽培 選擇有過(guò)氧化物酶分泌的黑木耳菌種接種于含培養(yǎng)料的菌袋中，常規(guī)培養(yǎng)，木耳采收后廢渣保存于4 ℃冰箱。

1.2.3 粗酶液的制備 將廢渣用粉碎機(jī)粉碎，用pH 6.5緩沖液按每千克廢渣用1 L提取液的比例浸泡，浸泡液先用6層紗布過(guò)濾，然后用低溫10 000 r/min離心10 min，去沉淀，上清液即為粗酶液。

1.2.4 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的檢測(cè) 選取“1.2.1”有變色圈出現(xiàn)的菌種的粗酶液，于無(wú)菌條件下取750 μL粗酶液、100 μL 1 mmol/L的亞甲基藍(lán)、150 μL 0.5 mol/L的酒石酸鉀鈉緩沖液（pH 4.0）溶液混合，再向體系中加入50 μL 4.5 mmol/L的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)。以滅活的粗酶液反應(yīng)體系作空白對(duì)照，若反應(yīng)體系由淡藍(lán)綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色，則表明有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶產(chǎn)生，否則無(wú)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶產(chǎn)生[5]。

1.2.5 漆酶活力測(cè)定 選用4 mL反應(yīng)體系，3.5 mL PBS緩沖液，0.1 mL酶液，0.4 mL ABTS，反應(yīng)3 min后在410 nm條件下測(cè)定吸光度，測(cè)定初始值后每隔1 min測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5～6次，反應(yīng)30 min后測(cè)定最終OD值，重復(fù)3次。酶活力用待測(cè)樣與ABTS反應(yīng)30 min的OD值表示，1個(gè)酶活力單位以每分鐘吸光度增加0.1的酶量來(lái)表示[6]。

1.2.6 Mn-過(guò)氧化物酶活力測(cè)定 Mn-過(guò)氧化物酶的活力利用可見(jiàn)分光光度計(jì)于470 nm處對(duì)2，6-二甲基苯酚的氧化情況進(jìn)行測(cè)定[7]。測(cè)定體系4 mL，其中丙二酸鈉緩沖液3 360 μL（50 mmol/L），MnSO4 200 μL，2，6-二甲基苯酚200 μL（10 mmol/L），酶液樣品200 μL，H2O2 100 μL（10 mmol/L），以去離子水作對(duì)照，測(cè)定470 nm處1 min內(nèi)吸光度變化值，自加入H2O2溶液后開(kāi)始反應(yīng)，每分鐘測(cè)定1次，連續(xù)5～6次。酶活（U）為上述條件下，每分鐘催化1 μmol 2，6-二甲基苯酚所需的酶量[8]。每個(gè)待測(cè)樣品平行操作3次。

1.2.7 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力測(cè)定 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的活力利用可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)于310 nm處檢測(cè)藜蘆醇的變化[9]。測(cè)定體系4 mL，其中pH 3.0， 100 mmol/L的丙二酸鈉緩沖液1 360 μL，20 mmol/L的黎蘆醇溶液400 μL，酶液樣品2 200 μL，54 mmol/L的H2O2 40 μL，以去離子水作對(duì)照，自加入H2O2溶液后開(kāi)始反應(yīng)，每分鐘測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)5～6次[10]。酶活（U）為上述條件下，每分鐘催化1 μmol/L藜蘆醇所需的酶量。每個(gè)待測(cè)樣品平行操作3次。

1.2.8 木質(zhì)素降解酶系最適溫度和最適pH的測(cè)定

1）最適溫度的測(cè)定。分別在20～44 ℃每提高3 ℃梯度條件下測(cè)定Mn-過(guò)氧化物酶、漆酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力，并繪制溫度對(duì)酶活力的影響曲線。

2）最適pH的測(cè)定。分別在測(cè)定Mn-過(guò)氧化物酶、漆酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶反應(yīng)體系下，設(shè)置緩沖液pH為4.6～7.8（梯度值為0.4），分別測(cè)定3種酶活力并繪制活力曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)過(guò)氧化物酶野生黑木耳菌種篩選

在含Azure B的PDA平板培養(yǎng)基上接種3 mm的菌塞進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h觀察1次，37株菌株有35個(gè)樣本培養(yǎng)基中出現(xiàn)變色圈。對(duì)35個(gè)樣本的菌絲圈及變色圈直徑進(jìn)行測(cè)量，平均測(cè)量值如表1所示。將上述有變色圈產(chǎn)生的菌種利用亞甲基藍(lán)溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，其中TH11和TH20菌種反應(yīng)體系明顯變藍(lán)，即這2個(gè)菌種有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶產(chǎn)生。

2.2 廢渣中漆酶活力的測(cè)定

在測(cè)定時(shí)間內(nèi)，410 nm處的吸光度變化明顯，漆酶活力變化趨勢(shì)如圖1所示。自反應(yīng)3 min后，酶活力在測(cè)定時(shí)間內(nèi)呈明顯的上升趨勢(shì)。經(jīng)計(jì)算，野生黑木耳廢渣粗酶液中漆酶平均活力為54.3 U/L。

2.3 廢渣中Mn-過(guò)氧化物酶活力的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，Mn-過(guò)氧化物酶酶活力變化趨勢(shì)明顯，吸光度變化曲線如圖2所示。廢渣中Mn-過(guò)氧化物酶的活力在2 min內(nèi)呈迅速上升趨勢(shì)，至4 min內(nèi)上升趨緩，之后基本維持不變。經(jīng)計(jì)算，Mn-過(guò)氧化物酶平均活力為37 200 U/L。

2.4 廢渣中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在測(cè)定時(shí)間內(nèi)，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力變化趨勢(shì)較緩，吸光質(zhì)變化曲線如圖3所示。在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，雖能檢測(cè)到木質(zhì)素過(guò)氧化物酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物，但吸光度變化緩慢。經(jīng)計(jì)算，廢渣中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶平均活力為6.7 U/L。

2.5 黑木耳木質(zhì)素降解酶系最適溫度和pH的測(cè)定

為測(cè)定黑木耳木質(zhì)素降解酶最適溫度和最適pH，選擇黑木耳天然生長(zhǎng)pH和溫度范圍設(shè)定試驗(yàn)處理。最適溫度檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，最適pH檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。試驗(yàn)中3種木質(zhì)素降解酶的最適溫度都集中在28～32 ℃，最適pH則分布在6.2～7.0。上述結(jié)果均在本試驗(yàn)所用底物條件下測(cè)得，如果選擇底物有差異，則測(cè)定的最適溫度和最適pH會(huì)有所變化，尤其是最適pH受底物影響尤為明顯。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)重篩黑木耳廢渣中的木質(zhì)素降解酶進(jìn)行了初步測(cè)定。一般黑木耳野生菌種大多不產(chǎn)生木質(zhì)素過(guò)氧化物酶，本試驗(yàn)從37株野外采集的黑木耳菌株中進(jìn)行篩選，共獲得2株有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性的菌株。對(duì)代料栽培黑木耳后培養(yǎng)料廢渣中3種酶活力進(jìn)行測(cè)定，其中Mn-過(guò)氧化物酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩種，達(dá)到37 000 U/L，而木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活力極低，僅有6.7 U/L。

木質(zhì)素降解酶是真菌利用纖維素、木質(zhì)素等生產(chǎn)供其代謝糖類(lèi)的最重要酶類(lèi)，木質(zhì)素降解酶系酶活的高低決定了真菌利用木質(zhì)素的效率。現(xiàn)階段，黑木耳代料栽培培養(yǎng)料中木屑的成本和來(lái)源問(wèn)題成為黑木耳栽培的一個(gè)重大限制因素，而替換木屑的秸稈、稻草等因木質(zhì)素結(jié)構(gòu)與硬木不同，使得黑木耳木質(zhì)素降解酶與底物結(jié)合受限，酶活力不高，從而導(dǎo)致木耳產(chǎn)量低，質(zhì)量差。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)黑木耳木質(zhì)素降解酶的研究，為后續(xù)利用育種技術(shù)選育具有高木質(zhì)素降解酶活力的菌種，使其更適應(yīng)秸稈、稻草等硬木屑替代培養(yǎng)料，為提高木耳產(chǎn)量與質(zhì)量奠定前期物質(zhì)基礎(chǔ)。

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