酶法合成油酸丙二醇單酯

胡源媛　凌紅妹

【摘 要】 本研究利用商品化的固定化脂肪酶催化油酸和1，2丙二醇酯化反應(yīng)制備丙二醇單酯，考察了不同脂肪酶和反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)及其脂肪酸專一性的影響。結(jié)果表明，Lipozyme RM IM對油酸具有較好的專一性，在制備1，2-丙二醇單酯時具有更高的催化效率，在酶反應(yīng)溫度為55℃時酯化反應(yīng)6h后酯化率可以達(dá)到54.01%，丙二醇單酯的含量可以達(dá)到52.21%；利用分子蒸餾分離純化丙二醇單酯，在蒸餾溫度為140℃時，產(chǎn)物中丙二醇單酯的含量可以達(dá)到94.7%，回收率可以達(dá)到97%以上。

【關(guān)鍵詞】 丙二醇單酯 酶催化 高純度

【Abstract】 In this study， propylene glycol monoesters were synthesized by commercially immobilized lipase-catalyzed esterification of propylene glycol and oleic acid. Effects of different lipases and temperature on the esterification and the specificity of fatty acids were studied， respectively. The obtained results suggested that Lipozyme RM IM showed high preference for oleic acid as well as high catalytic efficiency in synthesis of propylene glycol monoesters. Propylene glycol monoester content as high as 52.21% was obtained with an esterification rate of 54.01% after 6h under 55 °C. After further purification of propylene glycol monoesters by short path molecular distillation at 140 °C， high propylene glycol monoesters content of 94.7% was obtained accompanying with a recovery yiled of more than 97%.

【Keywords】 Propylene glycol monoesters； Enzymatic catalysis； High purity

丙二醇脂肪酸單酯是一種優(yōu)良的非離子型乳化劑，可以形成穩(wěn)定的油包水體系（HLB值約為3.5），在食品和醫(yī)藥保健品中有廣泛的應(yīng)用。丙二醇脂肪酸單酯以α-晶型形式存在，沒有多晶性，能使其他乳化劑的α-晶型穩(wěn)定，還可以作為晶型調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于人造奶油和起酥油中[1]。已有研究表明，丙二醇脂肪酸單酯通過結(jié)合到高熔點脂肪晶體的晶格中從而起到調(diào)節(jié)晶型的作用。丙二醇脂肪酸單酯與甘油三酯的β晶型共結(jié)，從而阻止固態(tài)晶體向高熔點的β晶型轉(zhuǎn)變，丙二醇單酯不但能很好地起到抑制β晶型的甘油三酯向β晶型轉(zhuǎn)化的作用，而且本身沒有不良的色澤和色味，成為乳化劑中較優(yōu)的選擇[2]。

目前市場上流通的丙二醇單酯產(chǎn)品多為硬脂酸、棕櫚酸丙二醇單酯，長鏈飽和脂肪酸的丙二醇單酯是良好的固體脂肪晶型調(diào)節(jié)劑；但其熔點較高，難以作為液態(tài)油脂的乳化劑，在液態(tài)酥油等產(chǎn)品中應(yīng)用效果較差。不飽和脂肪酸型的丙二醇單酯熔點低，而且保留了良好的乳化性能。由于不飽和脂肪酸的穩(wěn)定性較差，物理和化學(xué)工藝難以合成品質(zhì)良好的不飽和脂肪酸丙二醇單酯產(chǎn)品。而脂肪酶催化的生物合成工藝，具有活性高、專一性好以及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥制品的生物法制備。李偉等[3]，在無溶劑體系中，以固定化脂肪酶Novozym 435催化1，2-丙二醇月桂酸合成1（2）-丙二醇月桂酸單酯，酯化率可以達(dá)到91.89%，1（2）-丙二醇月桂酸單酯純度達(dá)到79.22%。鐘遇安等[4]以叔丁醇為溶劑，利用脂肪酶催化橄欖油與1，2-丙二醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)制備丙二醇單脂肪酸酯，產(chǎn)物中1（2）-丙二醇脂肪酸單酯的含量可以達(dá)到72.4%。汪運明等[5]，在無溶劑體系中，利用脂肪酶催化椰子油與1，2-丙二醇進(jìn)行醇解反應(yīng)，制備合成椰子油基丙二醇單酯，丙二醇單酯的生成量達(dá)到53.48%。

本研究，利用常用的商品化脂肪酶催化制備亞油酸型的丙二醇單酯，比較了不同脂肪酶對底物的專一性，并對酶法制備工藝進(jìn)行了考察，為開發(fā)不飽和脂肪酸丙二醇單酯的酶法制備工藝提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設(shè)備

1.1.1 材料和試劑

脂肪酶Novozym 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM均購自丹麥諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。1，2-丙二醇，分析純，上海凌峰試劑有限公司；油酸（純度97%），阿拉丁試劑公司；等摩爾脂肪酸混合物為實驗室自制。

1.1.2 儀器和設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器；ANKeTDL-40B臺式離心機(jī)；富斯特FX-8型旋片真空泵；Waters 2695 型高效液相色譜議，配備Waters 2414型示差檢測器（美國Waters公司）；MD-S80型分子蒸餾，廣州漢維冷氣機(jī)電有限公司。

1.2 酶法制備丙二醇脂肪酸單酯

脂肪酶催化亞油酸與丙二醇酯化制備丙二醇單酯，在50mL具塞三角瓶中按一定的底物摩爾比稱量一定量的油酸和1，2-丙二醇，底物混合物的質(zhì)量為17.8g；將三角瓶置于恒溫加熱磁力攪拌器中預(yù)熱到一定溫度，添加一定量的脂肪酶開始反應(yīng)，需要真空條件下反應(yīng)時連接真空泵，并每隔一定時間取樣，分析反應(yīng)混合物中的組成。

1.3 酯化產(chǎn)物HPLC分析

取1mL反應(yīng)混合物，在10000 r/min下離心5min，取上層油相0.02mL于2mL EP管中，加入0.5g的無水硫酸鈉，1mL的流動相（正己烷：異丙醇：甲酸=18：1：0.003），膜過濾后進(jìn)行高效液相色譜分析。

液相色譜為配備Waters 1525視差檢測器的waters2695系統(tǒng)；色譜柱為Phenomenex Luna Silica （2） （4.6 mm i.d. × 250 mm， 5μm particle size），色譜柱溫為30C，流動相流速1.0 mL/min。（物質(zhì)的出峰順序為：1，2-丙二醇二酯、油酸、1-丙二醇單酯、2-丙二醇單酯，不同組分利用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性，各個組分含量按面積歸一化法進(jìn)行計算。

1.4 脂肪酶對脂肪酸專一性考察

在25ml具塞三角瓶中加入1.7g等摩爾脂肪酸、0.79g1，2-丙二醇、和50mg固定化酶，50℃反應(yīng)10min，10000rpm離心3min后，將油相全部轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入4mL 30% KOH-乙醇溶液，充分混勻混勻后加入10mL正己烷萃取，回收正己烷相，揮發(fā)除去正己烷后進(jìn)行甲酯化處理，用氣相色譜分析甲酯的脂肪酸組成；氣相色譜方法，采用文獻(xiàn)[6]中的分析方法。

脂肪酶催化脂肪酸與丙二醇酯化反應(yīng)中，競爭因子（α）的倒數(shù)（1/α）稱為底物專一性常數(shù)（kcat/Km），用于評價脂肪酶的脂肪酸的特異性。由 Rangheard 等[7，8]提出的反應(yīng)底物的競爭因子應(yīng)用于描述脂肪酶的脂肪酸的特異性。

1.5 酯化率計算

2 結(jié)果與討論

隨著生物化工技術(shù)的發(fā)展和酶制劑生產(chǎn)技術(shù)的提高，脂肪酶的生產(chǎn)工藝越來越成熟，從而使得脂肪酶的生產(chǎn)成本逐漸降低，脂肪酶可以更加廣泛地應(yīng)用于食品和化工領(lǐng)域。脂肪酶催化合成醫(yī)藥和食品中常用乳化劑是一個長期研究的課題，部分研究成果已經(jīng)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。本研究，利用商品化脂肪酶開發(fā)不飽和脂肪酸丙二醇單酯生產(chǎn)技術(shù)，為酶法制備丙二醇單酯技術(shù)的應(yīng)用和推廣提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

2.1 脂肪酶對酯化反應(yīng)制備丙二醇單酯的影響

脂肪酶是一種具有良好的底物特異性的生物催化劑，包括其對甘油酯底物的專一性（如一酯、二酯、三酯等）、酰基/羥基位置專一性等。本研究考察不同脂肪酶催化脂肪酸與1，2-丙二醇進(jìn)行酯化反應(yīng)時，催化劑對丙二醇羥基位置專一性對酯化反應(yīng)制備丙二醇單酯的影響，結(jié)果如圖1和圖2所示。

由圖1可以看出，在本反應(yīng)體系中Lipozyme TL IM不能催化油酸和丙二醇進(jìn)行酯化反應(yīng)，這可能是由于其載體為極性材料硅膠，而硅膠很容易被丙二醇包裹，極大地降低了傳質(zhì)效果；Lipozyme RM IM和Novozym 435均可以催化油酸和丙二醇進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)6h后酯化率基本達(dá)到平衡；與Novozym 435相比，Lipozyme RM IM具有更高的催化效率。

由圖2可以看出，酯化產(chǎn)物以丙二醇單酯為主，而且在酯化反應(yīng)達(dá)到平衡時，以Lipozyme RM IM為催化劑的反應(yīng)體系中，丙二醇單酯的含量更高；以Novozym 435為催化劑的反應(yīng)體系中，酯化反應(yīng)在1h后丙二醇單酯的含量達(dá)到最高，繼續(xù)反應(yīng)時丙二醇單酯的含量逐漸降低，這是由于Novozym 435對丙二醇Sn-1和Sn-2位羥基的位置專一性較弱，可以催化1（2）-單酯與油酸繼續(xù)酯化成為丙二醇二酯。液相色譜分析顯示，Lipozyme RM IM催化酯化反應(yīng)產(chǎn)生的單酯以1-丙二醇單酯為主，這說明Lipozyme RM IM對于1，2-丙二醇的sn-1位羥基具有較強的位置專一性，適用于酶法合成丙二醇單酯。

2.2 脂肪酶對脂肪酸專一性的影響

脂肪酸是脂肪酶的天然底物，不同的脂肪酶對脂肪酸專一性也有很大差別，脂肪酸的碳鏈長度、雙鍵數(shù)目及雙鍵的位置均對脂肪酶的催化活性有顯著影響。例如，來源于南極假絲酵母的脂肪酶Lipase CALB和來源于玫瑰假絲酵母的脂肪酶Lipase AY30，對于共軛亞油酸（CLA）中的雙鍵位置具有相反的專一性，因而被用于CLA異構(gòu)體的酶法拆分。本研究考察了脂肪酶Lipozyme RM IM、Novozym 435在催化脂肪酸與丙二醇酯化時對常見脂肪酸的專一性，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，在本反應(yīng)體系中，與常見的不飽和脂肪酸（油酸、亞油酸、亞麻酸）相比，Novozym 435對飽和脂肪酸的催化活力更高。而Lipozyme RM IM在催化脂肪酸與1，2-丙二醇進(jìn)行酯化反應(yīng)時，對不飽和脂肪酸的催化活力更高，對油酸的專一性最強，因此可以選擇Lipozyme RM IM進(jìn)行酶法合成油酸丙二醇單酯酶法合成工藝的研究。

2.3 反應(yīng)溫度對酯化反應(yīng)合成丙二醇單酯的影響

反應(yīng)溫度是影響酶促反應(yīng)的重要因素，在酯化反應(yīng)體系中，溫度不僅可以影響脂肪酶的催化活力，也會對丙二醇單酯中脂肪酸酰基轉(zhuǎn)移的速率產(chǎn)生影響。本研究考察了以Lipozyme RM IM為催化劑，酯化合成1，2-丙二醇單酯時溫度對酯化率和丙二醇含量的影響，結(jié)果如圖4和圖5所示。

由圖4可以看出，反應(yīng)溫度對酯化率有顯著影響，在45°C到55°C之間時，隨著溫度的上升，酯化反應(yīng)速率迅速增加。當(dāng)酯化反應(yīng)溫度達(dá)到60°C后，反應(yīng)速率下降，并且1h后酯化率上升不顯著，這可能是由于溫度過高，使得脂肪酶失去了催化活力。由圖5可以看出，在45°C到55°C之間，隨著溫度的升高，丙二醇單酯的含量也顯著增加，其中反應(yīng)溫度為55°C時，酯化反應(yīng)體系中丙二醇單酯的含量最高，可以達(dá)到51%以上。

2.4 丙二醇單酯的分離純化

酯化反應(yīng)產(chǎn)物中含有未反應(yīng)的脂肪酸、1，2-丙二醇，要得到丙二醇單酯的產(chǎn)品，需要對酯化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。目前，分離純化丙二醇單酯的方法有分子蒸餾、溶劑萃取以及堿中和法。其中，分子蒸餾工藝分離回收丙二醇單酯得率高，而且無溶劑殘留等問題。

本研究將酯化反應(yīng)混合物離心回收上層油相得到脂肪酸與丙二醇酯的混合物，下層的固定化酶和未反應(yīng)的丙二醇可以回收再次利用。上層油相通過分子蒸餾分離回收丙二醇單酯，在進(jìn)料速度為36ml/min，蒸餾壓力4.1Pa時對分子蒸餾溫度對產(chǎn)物中丙二醇單酯的含量及其得率的影響進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖6所示。

蒸餾溫度是影響分子蒸餾分離純化丙二醇單酯的關(guān)鍵參數(shù)，由圖6可以看出，在溫度由100℃升高至140℃過程中，產(chǎn)物中丙二醇單酯的含量逐漸升高，在140℃時達(dá)到94.7%，而且此時丙二醇單酯的得率可以達(dá)到97.6%，這說明在此蒸餾條件下，脂肪酸和丙二醇單酯實現(xiàn)了良好的分離；繼續(xù)升高蒸餾溫度至150℃時，丙二醇單酯的含量增加不顯著，但是其得率顯著降低（90.1%），這可能是由于蒸餾溫度過高，丙二醇單酯也隨著輕組分一起被蒸餾出來，使得重相組分中的丙二醇單酯的含量降低。

3 結(jié)語

本研究考察了不同商品化的固定化脂肪酶催化油酸與1，2-丙二醇酯化制備丙二醇單酯的效果，發(fā)現(xiàn)Lipozyme RM IM對油酸的選擇性最高，而且適用于無溶劑體系中制備油酸丙二醇單酯。通過對酶反應(yīng)溫度的考察確定了在酶反應(yīng)溫度為55°C時，酯化率最高，而且酰基轉(zhuǎn)移效率較低，丙二醇單酯的得率最高；利用分子蒸餾分離純化酯化反應(yīng)產(chǎn)物中的丙二醇單酯，得到含量為94.7%的丙二醇單酯產(chǎn)品，其得率可以達(dá)到97.8%。

參考文獻(xiàn)：

[1]Robert J Whitehurst. Emulsifiers in food technology[M].Black Well，2006：186，196-199.

[2]宋慧穎，徐學(xué)明.不同丙二醇單酯對脂肪物性影響的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，09：137-141+145.

[3]李偉，張凱，李宏永，陳華勇，王永華，楊博.無溶劑體系固定化脂肪酶催化合成1（2）-丙二醇月桂酸單酯[J].中國油脂，2010，12：44-47.

[4]鐘遇安，姜土，吳煒亮，楊修斌.酶法制備丙二醇單酯的研究[J].食品與機(jī)械，2012，05：42-45+70.

[5]汪運明，覃小麗，王衛(wèi)飛，楊博，王永華.酶法制備椰子油基丙二醇單酯的研究[J].中國油脂，2012，10：28-31.

[6]Weifei Wang， Tie Li， et al. A process for the synthesis of PUFA-enriched triglycerides from high-acid crude fish oil. J Food Eng.2012， 109： 366-371.

[7]Rangheard M.S， Langrand G， et al. Multi-competitive enzymatic reactions in organic media： a simple test for the determination of lipase fatty acid specificity [J]. Biochimica et Biophysica Acta， 1989， 1004（1）： 20–28.

[8]Xiao‐Li Qin，Dong‐Ming Lan，Jin‐Feng Zhong，et al. Fatty acid specificity of T1 lipase and its potential in acylglycerol synthesis[J]. J. Sci. Food Agric，2014，948.