臨床生物樣本庫血液樣本的可控性采集和質量管理

吳曼麗，王柱清，羅 凱，康曉楠

臨床生物樣本庫血液樣本的可控性采集和質量管理

吳曼麗，王柱清，羅 凱，康曉楠

目的建立醫療過程中血液樣本可控性采集模式，保證樣本的采集、處理過程可回溯，為腫瘤、自身免疫性疾病、心腦血管疾病及代謝性疾病的研究提供高質量的血液樣本。方法通過建立網絡化樣本采集管理流程，將樣本采集電子申請、項目管理以及樣本處理中涉及血液樣本的各項前處理因素整合到電子工作程序中，保證標準流程的執行情況處于可控狀態，形成規范化的血液采集、前處理、保存和管理辦法。結果仁濟醫院血液樣本庫有臨床疾病20余種，含有完整的臨床及隨訪資料。血液樣本與相應的組織樣本、臨床信息相匹配；系統記錄每份樣本采集時間、到庫時間、入庫時間等；可通過組合查詢篩選相應質量要求的樣本。共采集血液樣本40 000余份，抽樣檢查90%的樣本分子生物學指標穩定。結論仁濟醫院可控性血液采集、處理模式和管理模式為綜合性醫院血液生物樣本庫建設提供管理經驗，為血液樣本的規范化、高質量采集、前處理、保存提供詳細操作經驗參考，為腫瘤、自身免疫性疾病、心腦血管疾病及代謝性疾病的研究提供高質量的血液樣本及信息資源。

樣本；生物樣本庫；血液樣本庫

配套的血液樣本和組織樣本及相應的信息是臨床生物樣本庫(簡稱樣本庫)收集的主要內容。血液樣本作為樣本庫的重要組成部分，其亞成分血漿、血清、紅細胞、白細胞、血小板、活性凍存外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)[1]、血凝塊、血液樣本衍生物(DNA、RNA)[2]都是基因組學、代謝組學、蛋白質組學等主要研究對象，在腫瘤、心腦血管疾病及代謝性疾病等重大疾病的基礎研究、轉化研究、臨床研究中發揮著重要作用[3]。

作為綜合性醫院的中心樣本庫，仁濟醫院樣本庫在上海市科學技術委員會、上海交通大學985工程專項課題的支撐下，根據國際生物和環境樣本庫協會、美國國家癌癥研究所國際規范[4-5]建設，目的是為醫院各特色疾病研究提供經過標準流程采集、中心化處理和規范保存的樣本資源平臺。樣本庫通過建立標準操作流程(standard operating procedure，SOP)來規范樣本的處理操作，從而保證樣本質量。但是在臨床工作實踐中，往往很難對這些流程環節進行監督和記錄，即SOP可控性不強。

血液樣本的生物學質量受到采集方式、采集時間、運送方式、運送溫度、離心條件以及后期存儲許多前處理因素[6]的影響。從流程管理的角度建設統一的、中心化的血液樣本可控性采集流程規范，可以兼顧多病種血液樣本管理，是大型醫院樣本庫的流程建設重要內容。按照疾病研究特點作為項目管理分類，實際工作中分為血液樣本處理小組(血液組，也包含其他體液處理工作)和組織樣本處理小組(組織組)，信息錄入時歸檔到統一的項目中，從而實現匹配樣本可以統一查詢；血液樣本雖然來自于各個疾病，但其采集處理原則相似，科學采集和保存血液樣本及其亞成分是最大程度地利用好這部分生物樣本的重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 耗材與試劑 一次性使用真空采血管(促凝劑、乙二胺四乙酸二鈉鹽、肝素鋰、枸櫞酸鈉，浙江拱東醫療科技有限公司)，細胞制備管(cell preparation tube，CPT，美國BD Vacutainer?公司)，1.5 mL離心管(上海萬格科學器材有限公司)，凍存盒(上海萬格科學器材有限公司)，RNAlater(美國Ambion公司)，德國QIAGEN基因組DNA提取試劑盒。

1.1.2 設備 二維碼標簽打印機及二維碼條(美國Brady公司)，臺式高性能離心機(美國Thermo公司)，微量離心機(美國Thermo公司)，自動化移液站(瑞士Tecan公司)，100～1000 μL移液器(德國Eppendorf公司)，二維碼掃描器(美國Honeywell公司)，超凈臺、海爾超低溫冰箱和臥式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)，NanoDrop 2000紫外分光光度計(美國Thermo公司)，臺式電腦(聯想控股有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 采血管類型、采集時間的采集方案確定 采集前需要根據研究方案以及將要使用的實驗方法，明確每個病種的血液采血管類型、采集時間及地點、血液樣本類型、采集數量、保存方式。

采血管類型主要依據研究目的、科研用途、下游實驗檢測方法等來確定，目前常見的采血管類型見表1。

表1 常見采血管類型

仁濟醫院樣本庫目前主要以儲備性采集為主，鑒于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)采血管可知用途范圍較廣，選用EDTA采血管分離血漿及血細胞；根據促凝管價格及適合的下流實驗用無添加劑的促凝管分離血清；基于CPT便于采集和處理，以CPT分離PBMC。仁濟醫院一般采用的幾種采血管類型見表2。

表2 仁濟醫院選用的采血管類型

采集時間根據不同項目研究目的設計。仁濟醫院目前一般以術前清晨空腹采集及隨訪清晨空腹采集為主，還包括相關項目采集術前、術后24 h、術后2 d清晨空腹血樣本。

1.2.2 項目信息管理 不遵守采樣操作規程的生物標志物檢測研究具有極大的偏差風險。仁濟醫院自主開發信息管理系統，在樣本管理流程上，如電子記錄的辦法，根據每個病種特點在軟件中設計樣本采集流程模塊，通過血液樣本采集SOP與分析前編碼標準結合，將分析前編碼標準的理念融合到樣本信息管理系統的每一步。通過質量控制結果，分析信息系統與質量控制的樣本相關前處理變量，調整、改進采集流程，不斷提升與控制樣本質量，實現質量管理。

仁濟醫院信息管理與血液樣本采集、處理、保存、質量控制流程見圖1。

圖1 仁濟醫院信息管理與血液樣本采集、處理、保存、質量控制流程

通過軟件系統實現可控性采集。科室通過樣本庫網絡信息管理系統完成樣本申請。

樣本申請單中可以通過住院號、身份證號或門診號三者任何一個信息經接口對接臨床信息平臺，從而獲取包括患者姓名、性別、年齡、出生日期、住院號、身份證號或門診號、入院診斷；血液樣本自身相關信息包括樣本采血管類型、采集時間及地點、樣本采集人員、樣本有無溶血、樣本到庫時間、運輸溫度、離心速度、離心溫度、離心時間、樣本離心次數及離心延遲時間、樣本分裝體積、樣本儲存管唯一編碼、亞組分類型(血漿、血清、血細胞等)、入庫時間、入庫位置、保存溫度、有無凍融，所有字段都可以作為檢索詞用于查找樣本。同時，可以通過患者管理接口對接醫院臨床信息系統，方便查詢捐贈者其他臨床信息如臨床診斷、病理診斷、檢驗報告、影像報告、手術類型、用藥情況、治療方法、手術時間及地點、主治醫生、個人病史。

1.2.3 仁濟醫院血液樣本采集 仁濟醫院血液樣本及信息采集由門診及各科室醫務人員、護理人員按要求在門診和病房中完成，可以登錄網絡化樣本信息管理系統。患者捐獻的血液體積一般為4 mL促凝血或抗凝血；血液采集通常與臨床檢驗采集時間一致，避免增加患者痛苦，采血順序通常為先采集促凝血、后采集抗凝血。促凝血采集后，需室溫放置25～30 min以促進凝血(表2)，而后置于濕冰上，立即轉運至樣本庫；抗凝血采集完成后，應輕輕顛倒采血管8次，而后低溫轉運至樣本庫。CPT采血完成后，應顛倒6～8次，室溫保存。

血液樣本自樣本離體至處理的最佳時間為2 h以內，不宜超過6 h(CPT為24 h)，采集至處理前應避免采血管過度震蕩，防止溶血。

1.2.4 血液樣本自動化工作站前處理 綜合性樣本庫樣本量較大，如何快速處理并儲存大量樣本且充分保證樣本質量及信息準確性成為一個難題。仁濟醫院樣本庫采用瑞士Tecan公司自動化移液站批量處理血液樣本，提高大量樣本處理速度的同時，保證樣本質量和樣本處理的一致性，并減輕樣本庫工作人員工作強度及人為失誤。以不同顏色的1.5 mL凍存管保存并將每個樣本賦予樣本類型及唯一二維碼，便于統計分析、信息及實體入庫。

血液樣本前處理以6 h內完成為宜，并應詳細記錄樣本前處理變量。

1.2.4.1 抗凝血及促凝血前處理 抗凝血轉運與前處理完成前應使樣本處于2～8℃，以最快速度完成處理。處理步驟:將采血管輕柔顛倒混勻3次，3 000 g 4℃離心10 min，所得上清為血漿或血清，剩余為血細胞或血凝塊。若為進行血漿外泌體或腫瘤早期診斷等研究，需將血漿二次離心，15 000 g 4℃離心5 min，之后根據程序提示分離血細胞。

1.2.4.2 CPT抗凝血前處理 CPT抗凝血需室溫保存。室溫1 600 g離心30 min，液面從上至下依次分為血漿、白細胞、凝膠層、血小板與紅細胞4層。吸取最上層血漿并分裝；吸取血清下層的白色、云霧狀PBMC層，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次后，加入500 μL RNAlater重懸并吹打混勻，4℃過夜后，轉移至－80℃冰箱。

1.2.5 血液樣本實體入庫、保存和分發 血液樣本保存溫度取決于分析物的性質，一般－80℃足以保存廣泛的血液樣本[7]。仁濟醫院目前選用－80℃冰箱保儲血液樣本。仁濟醫院樣本庫儲存區設39臺－80℃冰箱，其中臥式－80℃整理冰箱2臺，存儲空間接近200萬份庫容；并設有應急冰箱4臺，防止因冰箱故障致使樣本質量受損。－80℃冰箱均在信息系統預設有凍存盒結構，便于提高出入庫效率。冰箱采用自動化溫度檢測系統，連續檢測并記錄所有儲存設備實時動態溫度，使樣本保存溫度可回溯化，報警溫度為－65℃。樣本庫房側壁及天花板裝有自動化溫度傳感器，報警溫度上限為35℃、下限為0℃。

樣本轉運裝置維持溫度取決于樣品的性質和后續分析方法。樣本可以在室溫(20～30℃)、冷藏(2～8℃)、冷凍(－20℃、－70℃)條件下及液氮罐中轉運。

1.2.6 血液樣本質量控制 血液樣本質量控制包括信息質量控制、生物學質量控制。

1.2.6.1 信息質量控制 按照每月實現約樣本總量的1%隨機抽取樣本進行核對，包括位置信息是否正確、條碼是否脫落或漏貼、樣本相關信息是否完整等。

1.2.6.2 生物學質量控制 生物學質量控制包括全血DNA、RNA、蛋白質等。按照病種和樣本類型隨機抽出100份血細胞樣本，提取其中 DNA及RNA，分光光度計法測定DNA、RNA濃度，光密度(optical density，OD)值OD260/OD280檢測其純度，以美國Agilent 2100生物芯片分析系統檢測DNA、RNA的完整性。

2 結果

2.1 信息系統建設與信息管理 仁濟醫院網絡化流程管理基于瀏覽器/服務器架構，平臺直觀、方便，科室、門診設有樣本電子申請模塊，與樣本庫軟件實時對接。樣本采集流程與臨床工作相適應。設置樣本前處理因素電子記錄模塊，全程記錄樣本數據。注重同一患者不同時間點和不同類型樣本的配套性和完整性。通過醫院信息科，將樣本信息與醫院信息系統、實驗室信息系統、手術麻醉系統相對接。仁濟醫院每月血液樣本采集總量約4 000份，每個月對40份樣本進行信息核對，其中約99%樣本位置信息正確、信息完整。

2.2 樣本儲存總量 仁濟醫院形成以泌尿科疾病樣本(如前列腺癌、膀胱癌、腎癌)為特色，涵蓋有風濕科、內分泌科、血管外科等24種疾病項目的特色、綜合、大型的生物樣本庫。共采集血液樣本41 061份，其中血清樣本8 300余份、血漿樣本15 500余份、血細胞樣本15 500余份、血凝塊樣本1 600余份、白細胞樣本100余份(圖2)。每份獨立樣本均包含完整的臨床資料及樣本處理信息。目前已出庫血液樣本15 00余份，共服務9個項目，涉及課題金額2 000余萬元。

圖2 各樣本類型及各科室樣本采集總量

2.3 生物學質量控制 血液樣本質量控制主要通過流程控制、信息完善、大分子檢測等方法實現。醫院樣本庫隨機抽出的100份血液樣本，經－80℃凍存1～2年后，血細胞樣本經DNA和RNA提取，可得高濃度的DNA及RNA，約90%樣本所得DNA OD260/ OD280＝1.6～1.8、RNA OD260/OD280＝1.8～2.0。其中血細胞樣本經Aglient 2100檢測，所得RNA 80%完整性參數(RNA integrity number，RIN)＞7，白細胞90%以上RIN＞7。

3 討論

信息系統建立的根本目的在于:①實現多種信息系統與樣本之間的準確對接，便于數據整合，精確、高效指導科學研究；②準確再現樣本生命周期全過程，保證樣本下游分析結果的可回溯性，為科學研究提供真實、可靠樣本信息；③便于科研人員快速、適時掌握儲存樣本和動態樣本儲存情況查詢、隊列樣本儲存情況查詢、批量樣本出庫查詢等；④便于生物樣本庫進行信息管理、信息查詢、信息統計以及實體和信息入庫、出庫工作。因此，信息管理軟件應與醫院信息系統、實驗室信息系統、影像歸檔和通信系統相對接。同時，應具備詳細的樣本捐贈者信息、真實的、可回溯的樣本前處理信息。建立圖形化入庫虛擬空間，便于快速入庫，減少樣本在室溫或低溫暴露時間；還應包括快速查詢模塊、入庫出庫模塊、統計分析功能等。

血液樣本采集、轉運、前處理、保存的關鍵在于:①建立正確采集方案；②最大限度保證樣本生物學活性；③規范化、標準化操作，保證樣本及其對應信息準確性；④真實記錄每個樣本生命周期各個流程操作信息。

血液采集前，應根據需求確定采血管類型、采集時間、數量。抗凝劑的選擇對于后續樣本分析具有重要影響[8-9]。EDTA可維持血漿內生物大分子的穩定，適用于基于基因組、表觀基因組及蛋白質組、代謝組學、細胞學相關研究[10-11]；枸櫞酸鈉抗凝劑有利于維持細胞形態及活性[12-13]，適用于功能性凝血因子測定；肝素會與某些蛋白結合并影響基于聚合酶鏈反應的后續基因分析[14]；肝素鋰、肝素鈉采血管處理的血漿適用于代謝組學研究，但會影響淋巴細胞增殖[15]、中性粒細胞恢復效率[11]；CPT適用于細胞學如PBMC分離、流式細胞術相關研究。血液樣本采集時間一般由科室提出并制定，可供參考的血液樣本采集時間為手術前當天于手術室采集及手術后24、48 h采集。采集總體積一般為4 mL，基本可以滿足基因組、蛋白質組、代謝組以及血漿外泌體分析。除此之外，采集時間點、麻醉前或后、靜脈或動脈采集方式都將影響某些生物標志物的水平[16]。在樣本轉運及前處理過程應以最快速度并盡量在低溫環境完成，以減少生物分子降解，避免提取量及活性降低。前處理完成后，盡快將樣本凍存于－80℃超低溫冰箱或液氮中[17]。槍頭、離心管與樣本直接接觸的器材需高壓滅菌，樣本分裝份數不小于3份。

前處理完成后，樣本可先浸液氮，可使樣本溫度迅速降低，減少降解。仁濟醫院血液樣本保存溫度－80℃，結果表明大多數血液樣本生物學指標穩定。一般血清及血漿保存于－80℃即可穩定維持DNA、蛋白質及代謝物活性[18-21]。

血液樣本質量控制是不斷循環持續改進的動態過程，主要通過流程控制、信息完善、大分子檢測等方法對樣本采集、轉運、前處理等與樣本質量相關因素進行檢測并持續改進而實現。在血液樣本生物大分子質量控制方面，除仁濟醫院血液樣本庫采用的對樣本中DNA進行質量控制外，還可對血漿、血清、血細胞樣本中蛋白質進行質量控制，可采用蛋白濃度測定法如聚氰基丙烯酸正丁酯法[22]、酚試劑法[23]測定蛋白質濃度，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測樣本中所含有的總蛋白完整性，以蛋白質印跡法檢測特異性蛋白的含量[24-25]；還可以通過對血細胞及白細胞中的RNA進行質量控制，提取RNA后，檢測RIN[26]。目前仍缺乏特異性的血液樣本質量控制標志物。

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The controllability collection and quality management of clinical biobank for blood biospecimen

WU Manli，WANG Zhuqing，LUO Kai，KANG Xiaonan
(Renji Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200127，China)

Objective The aim of the Renji hospital biobank blood sample controllability collection and quality management is to establish a blood sample controllable acquisition mode for medical procedure，ensure that the sample collection，the process can be traced back and provide high-quality blood samples for cancer，autoimmune diseases，cardiovascular diseases and metabolic diseases research.Methods Integrated the sample collection electronic filing，project management as well as the various preanalytical variables of blood sample to electronic work program through the establishment of the network management process to ensure the implementation of standard processes under control，formed a standardized blood collection，pre-processing，conservation and management approach.Results Renji Hospital biobank has collected more than 20 kinds of clinical disease blood samples，and all samples contained the complete clinical follow-up data.Blood samples were correspond with tissue samples and matched with clinical information；information management system recorded each sample collection time，time to biobank and the storage time.Samples can be screened for the corresponding requirements through the information management system.Till now，Renji hospital has collected more than 40 000 blood samples，90%of them have stable molecular markers.Conclusion The controllable blood collection，processing and management model of Renji Hospital provide management experience for comprehensive hospital in construction of blood biobank，provide detailed experience reference for standard，high-quality，pre-process，storage，etc of blood specimen，and provide high quality boold specimen and information for cancer，autoimmune diseases，cardiovascular diseases and metabolic diseases research.

Specimen；Biospecimen；Blood biobank

R－05

A

2095-3097(2016)06-0327-06

10.3969/j.issn.2095-3097.2016.06.003

2016-06-29 本文編輯:徐海琴)

上海市科學技術委員會科研計劃項目(15DZ2292100)；上海市衛生計生系統重要薄弱學科建設計劃(2015ZB0206)

200127上海，上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院(吳曼麗，王柱清，羅 凱，康曉楠)

康曉楠，E-mail:xnkang7＠163.com