實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌

崔溢，張貴海

（石家莊博維生物科技有限公司，石家莊050071）

0 引言

蠟樣芽孢桿菌分布廣泛，常見于土壤、灰塵和污水中，在植物性食品和許多生熟食品中也常見；是一種好氧性、在厭氧情況下也可很好生長(zhǎng)的革蘭氏陽性桿菌。蠟樣芽孢桿菌大小為(1～1.3 μm)×(3～5 μm)能夠形成芽孢，菌體兩端較平整，多數(shù)呈鏈狀排列；其芽孢呈橢圓形，位于菌體中央稍偏一端[1]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入可被檢測(cè)到的熒光基團(tuán)，利用DNA復(fù)制時(shí)熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控DNA擴(kuò)增情況，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行分析的方法[2]。該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域當(dāng)中，比如嬰幼兒配方乳粉中阪崎腸桿菌和腸桿菌科的檢測(cè)[3]。

本研究使用全新的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)蠟樣芽孢桿菌（DSM 4282，DSM 4284和ATCC 11778）分別從包含性、不包含性、檢出限、穩(wěn)定性等方面進(jìn)行檢測(cè)。并對(duì)新方法進(jìn)行了充分討論。

1 材料和方法

1.1 材料

蠟樣芽孢桿菌菌株：DSM 4282，DSM 4284和ATCC 11778。

其他菌株：產(chǎn)氣莢膜梭菌DSM 11784，嗜肺軍團(tuán)菌ATCC 33153，鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311，大腸桿菌ATCC 8739。

所需耗材： 離心管（1.5ml），槍頭，微孔板。

所需試劑：蠟樣芽孢桿菌專用DNA提取試劑，蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒。

1.2 儀器

生物安全柜-2A級(jí)，PCR工作站（UV柜），熒光定量PCR儀，微型離心機(jī)，小型高速離心機(jī)，冰箱，天平，pH檢測(cè)儀，渦旋震蕩器，金屬浴鍋，微量移液器，離心管架，移液管等。

1.3 檢測(cè)方法

DNA的提取：將樣品離心，去除上清液，加入蠟樣芽孢桿菌專用DNA提取試劑，充分混勻后95℃培養(yǎng)5 min，之后13 000 g離心2 min，上清液即含有蠟樣芽孢桿菌的DNA可直接用于PCR。

PCR的建立：使用蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR的建立。每個(gè)PCR反應(yīng)中分別加入引物/探針混合液4 μL，2xPCR Master mix 10 μL，PCR級(jí)水1 μL，樣品DNA5 μL?？偣?0 μL體系。

PCR的運(yùn)行:將PCR反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行檢測(cè)。PCR程序?yàn)轭A(yù)變性：95℃10 min；擴(kuò)增：95 ℃ 10 min，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。同時(shí)收集FAM和VIC/HEX通道信號(hào)。并按照表1讀取結(jié)果。

表1 結(jié)果判讀

2 結(jié)果和分析

2.1 特異性（包含性與不包含性）

2.1.1 包含性

分別對(duì)蠟樣芽孢桿菌DSM 4282、DSM 4284的DNA稀釋了10倍、100倍，對(duì)ATCC 11778的DNA稀釋了10倍、100倍、1000倍進(jìn)行了包含性的測(cè)試，結(jié)果如表2所示。

表2 包含性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，在不同的稀釋倍數(shù)下，檢測(cè)的不同蠟樣芽孢桿菌菌株均有Ct值，測(cè)試結(jié)果均為陽性，沒有假陰性的現(xiàn)象產(chǎn)生。

2.1.2 不包含性

在不包含性實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)非蠟樣芽孢桿菌的DNA進(jìn)行了測(cè)試，分別是產(chǎn)氣莢膜梭菌DSM 11784，嗜肺軍團(tuán)菌ATCC 33153，鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311，大腸桿菌ATCC 8739，結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，在所測(cè)試的4種非蠟樣芽孢桿菌的菌株中FAM通道均沒有Ct值，而VIC/HEX通道均有Ct值。說明PCR順利進(jìn)行，所得結(jié)果均為真陰性結(jié)果，沒有假陽性現(xiàn)象產(chǎn)生。

2.2 靈敏度（檢出限）

為了檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的靈敏度，將提取的蠟樣芽孢桿菌DSM 4282，DSM 4284和ATCC 11778的DNA（初始質(zhì)量濃度為50 pg/μL）進(jìn)行逐級(jí)稀釋。表4為將初始DNA逐級(jí)稀釋到107倍時(shí)每個(gè)反應(yīng)所分別對(duì)應(yīng)的DNA含量和基因組當(dāng)量。表5為檢測(cè)結(jié)果。

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將蠟樣芽孢桿菌DSM 4282，DSM 4284和ATCC 11778的DNA稀釋到1 000倍時(shí)均有Ct值，此時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為0.25 pg。而將DNA稀釋到10 000倍時(shí)只有蠟樣芽孢桿菌ATCC 11778有Ct值。由于每個(gè)反應(yīng)里含有5 μL的DNA，故該方法的檢出限為0.005-0.05 pg/μL。

表4 不同稀釋倍數(shù)下對(duì)應(yīng)的基因組當(dāng)量

2.3 穩(wěn)定性

我們隨機(jī)選取了6個(gè)樣品進(jìn)行了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，分別是10倍稀釋的蠟樣芽孢桿菌DSM 4282，100倍稀釋的蠟樣芽孢桿菌DSM 4282，10倍稀釋的蠟樣芽孢桿菌DSM 4284,100倍稀釋的蠟樣芽孢桿菌DSM 4284,1 000倍稀釋的蠟樣芽孢桿菌ATCC 11778和產(chǎn)氣莢膜梭菌DSM 11784。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

通過重復(fù)性實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌的兩次檢測(cè)結(jié)果Ct值基本相同，而產(chǎn)氣莢膜梭菌DSM 11784的兩次測(cè)試結(jié)果均為陰性。說明該方法的穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)果與討論

加強(qiáng)對(duì)食品中蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)非常必要，尤其是在對(duì)食品安全需求越來越高的今天[4]。與傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測(cè)方法相比[5]，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)提供了一個(gè)全新的檢測(cè)思路。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有著特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

在包含性實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)所有的蠟樣芽胞桿菌不同菌株均能檢測(cè)出來；在不包含性實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)所有的非蠟樣芽胞桿菌的菌株均顯示為陰性；在靈敏度實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法顯示出了較高的靈敏度（0.05 pg/μL）；在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法顯示出良好的穩(wěn)定性。

總而言之使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)樣品中的蠟樣芽胞桿菌特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，有著良好的應(yīng)用前景。

表5 檢出限測(cè)試結(jié)果

表6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

[1]張偉偉，魯緋，張金蘭，等.食品中蠟樣芽孢桿菌的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2010（5）：1-4.

[2]黃留玉.PCR最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用[M].化學(xué)化工出版社,2011:52-53.

[3]崔溢，張貴海.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)阪崎腸桿菌和腸桿菌科[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2014（9）：41-43.

[4]SCHOENI JL,WONG AC.Bacillus cereus food poisoning and its toxins[J].Journaloffood protection.2005(3):636-648.

[5]中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn):GB/T26427—2010飼料中蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)[S].