魁蚶溶藻弧菌分離鑒定與藥敏試驗

韓風杰 徐文娜 劉 敏 李啟蒙 王雪鵬*（山東農業大學動物科技學院 山東 泰安 271018 山東省濟寧市泗水縣水利局）

魁蚶溶藻弧菌分離鑒定與藥敏試驗

韓風杰①徐文娜②劉 敏①李啟蒙①王雪鵬①*（①山東農業大學動物科技學院 山東 泰安 271018 ②山東省濟寧市泗水縣水利局）

本文從山東某魁蚶養殖區發病魁蚶和養殖水體中分離到一株優勢菌，人工感染試驗結果顯示，該菌能引起供試魁蚶發病，死亡率為100%，且發病癥狀與原發病癥狀相同，提示該菌是引起魁蚶死亡的主要致病菌。本研究對該菌形態、生理生化特征、16SrDNA及致病性進行了初步分析。結果顯示該菌株為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，該菌對頭孢拉定等9種藥物高度敏感，對氟哌酸等5種藥物中度敏感，對青霉素具有耐藥性。

魁蚶 溶藻弧菌 生理生化 致病性

魁蚶是我國沿海常見的一種重要經濟貝類，因其肉質細嫩、營養豐富，深受國內外消費者歡迎，是出口創匯的重要水產品之一。但是近十幾年來，隨著魁蚶養殖規模的逐年擴大，養殖環境惡化導致微生物疾病的流行而引發的養殖魁蚶的大規模死亡屢屢發生，已造成巨大的經濟損失，而弧菌（Vibrios）是導致魁蚶發病的主要致病菌。本研究對發病魁蚶優勢菌株進行分離、鑒定，并進行人工感染試驗和藥物敏感性分析，探討分析導致山東魁蚶大規模死亡的病原，旨在為魁蚶疾病研究提供理論依據，為魁蚶健康養殖提供一些參考資料。

1 材料與方法

1.1 發病魁蚶 于2015年8月份山東魁蚶發病高峰期，采集病狀特征明顯、瀕臨死亡的魁蚶?；疾】?殼長3cm左右)，表皮部分脫落、表面粘液較少，解剖發現外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發爛發白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分病蚶腮黏液明顯增多。

1.2 分離方法 無菌鹽水洗凈，用70%的酒精棉球對體表擦拭消毒，無菌手術刀開啟，取肝胰臟等部位無菌勻漿器中勻漿處理，zobell 2216E平板和TCBS平板劃線接種，28℃培養24 h后，選取優勢菌落進行重復劃線純化，純培養物于4℃冰箱中保存。

1.3 人工感染試驗 人工感染試驗在20L水族箱中進行，條件為溫度28℃，鹽度26.4，pH8.2，連續充氣，每組放16只2cm大小的魁蚶。每天換水1次，試驗組調節水體中細菌濃度為108cfu/mL，每日投單胞藻1次；對照組不加入菌體，按上述方法飼養；連續觀察12d，紀錄死亡狀況，并進行解剖和病原的再分離以確定是否死于攻毒活菌引起的感染。

1.4 細菌生化鑒定 按一般細菌常用鑒定方法[6]進行分離菌的生物學性狀測定，包括革蘭氏染色、形態觀察、生理生化特性測定(所用試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.5 16SrDNA克隆、測序 采用細菌16SrDNA序列擴增的通用引物對純培養的細菌16SrDNA序列進行PCR擴增。正向引物為5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物為5'AAGGAGGTGWTCCARCC-3'。所得PCR產物經純化后送上海生工進行序列測定。

1.6 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散法，在zobell 2216E培養基上培養24h，測量抑菌圈直徑。藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

2 結果與分析

2.1 細菌分離及其形態特征 經分離純化后，從病蛤中分離到1株優勢菌，分離到的菌株均為革蘭氏陰性直桿菌(圖1)，菌體直或稍彎，無莢膜，靠鞭毛運動。在TCBS (硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽)瓊脂平板上培養18h后，該分離菌株形成黃色扁平的大菌落(圖1)。

圖1 1:革蘭氏染色顯微鏡觀察(1000x)；2: 分離菌在TCBS上的生長特性

2.2 人工感染試驗 人工感染7d后，魁蚶開始出現死亡，9d后全部死亡，病死率為100%。于是初步判定2015年8月山東某養殖區魁蚶大批死亡主要是以該分離菌為主要病原體的傳染病所造成。

2.3 分離菌株生化特性 細菌分離株在40℃以上和4℃以下不生長，無鹽不生長，其生活特性見表1，根據表1可以可以看出，這些特性與相關文獻對溶藻弧菌的描述基本一致，認為該分離菌為溶藻弧菌，命名為Va-kh1。

表1 分離菌生化特征及其與標準溶藻弧菌的比較

2.4 16SrDNA克隆、測序 對Va-kh1株16S rDNA序列進行進化樹分析PCR擴增，所得結果見圖2，進一步證實該菌為溶藻弧菌。

圖2 Va-kh1進化樹

2.5 藥物敏感性試驗 利用紙片法測定16種抗菌藥物對致病菌的抑制作用，由結果可知，分離菌株該菌對頭孢拉定等9種藥物高度敏感，對氟哌酸等5種藥物中度敏感，對青霉素產生耐藥性。

3 討論

（1）溶藻弧菌感染海水養殖動物的報道比較多，但導致貝類病害發生的報道卻很少。本次樣品采集是在高水溫期，表明溶藻弧菌是容易高溫環境下生長并導致海水養殖動物的弧菌病，通過人工感染實驗可知，感染后的試驗魁蚶出現明顯的病癥：表皮部分脫落、表面粘液較少，解剖發現外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發爛發白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分病蚶腮黏液明顯增多，死亡率高達100%，從浸泡感染方式發病魁蚶處分離到與自然發病相同的細菌，因此可以確定該分離株是魁蚶發病的病原體。（2）從藥敏試驗結果來看，該溶藻弧菌對阿米卡星、復方新諾明、卡那霉素、菌必治、先鋒必、鏈霉素、慶大霉素、新霉素、頭孢拉定9種藥物高度敏感，對氟哌酸、利福平、頭孢噻吩、頭孢氨芐、氨芐青霉素5種藥物中度敏感，對四環素、青霉素G低度敏感，因此在疾病發生時可以適量投放一些抗菌性藥物，但值得注意的是目前在養殖過程中誤用、濫用抗生素和消毒劑等，影響了水體中微生態環境的平衡，可能導致了一些耐藥菌株的出現，但是合理選擇和使用有效的抗生素仍是目前和近期內控制疾病主要方法。為了更好的預防病害發生，塘養或池養魁蚶(灘涂除外)可以適量投放微生態制劑，如：芽孢桿菌和光合細菌，以達到生態防治的目的。

表2 菌株Va-kh藥敏試驗結果

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S851.61+3

A

1007-1733(2016)05-0013-02

2016–04–14）

山東省現代農業產業技術體系貝類創新團隊項目(SDAIT-14-07)

*通訊作者