豬圓環病毒2型LAMP檢測方法的建立

宋玉財 王官曉 王 彬 于曉云 劉洪明 于小川 王俊卿 徐曉靜（山東省煙臺市動物衛生監督所 264003）

豬圓環病毒2型LAMP檢測方法的建立

宋玉財 王官曉 王 彬 于曉云 劉洪明 于小川 王俊卿 徐曉靜（山東省煙臺市動物衛生監督所 264003）

本試驗首先以PCV2的ORF2基因作為靶基因設計4條特異性引物，再優化LAMP反應體系各成分以找到最佳配比，經過特異性與靈敏度試驗的驗證，最終建立快速檢測PCV2的LAMP方法。結果顯示，該方法最短可在1h內完成整個檢測過程，最小檢測量接近1拷貝質粒DNA，靈敏度遠高于本實驗室常用的PCR方法，且相同條件下PCV1、PPV、PRV均不發生擴增，特異性良好。除通過瓊脂糖凝膠電泳得到階梯狀條帶外，還可加入SYBR Green I染料肉眼判定結果。

豬圓環病毒2型 環介導等溫擴增

LAMP建立之初是作為一種創新的、用于體外擴增核酸的分子生物學技術，后續的研究發現，其許多特點使其在病原檢測中也有著不可比擬的優勢。本研究利用環介導等溫擴增技術(LAMP)建立了一種新的檢測豬圓環病毒2型(PCV2)核酸的方法，擴充了實驗室檢測抗原的方式，由于LAMP檢測方法擺脫了昂貴儀器的束縛，適合于條件受到限制的基層臨床診斷。此次嘗試為本實驗室在檢測PCV2方向提供了新的途徑，進一步改善之后也能為基層臨床診斷提供試劑盒選擇。

1 材料與方法

1.1 質粒與病毒來源 分別連接PCV2、PCV1整個病毒基因組的重組質粒pSK-PCV2-SD1、pMD18-T-PCV1為山東省畜禽疫病防治及繁育重點實驗室保存提供。豬細小病毒病滅活疫苗WH-1株由中牧實業股份有限公司提供、偽狂犬病活疫苗由吉林正業生物制品股份有限公司提供。

1.2 主要試劑 Bst DNA聚合酶(大片段)(美國New England Biolabs公司)、Betaine(美國Sigma-Aldrich公司)、MgSO4(美國Amresco公司)、Taq DNA聚合酶(Fermentas中國公司)、普通質粒小提試劑盒(天根生化科技北京有限公司)；SYBR Green I核酸染料、Tris平衡酚購自北京索萊寶科技有限公司；dNTP、DNA Marker DL-2000、蛋白酶K均購自寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.3 DNA模板的制備 （1）質粒的抽提：無菌條件下，取兩瓶的LB液體培養基，首先按1:1000的比例加入氨芐青霉素(Amp，100mg/ml)，搖勻后再分別以1:100接種含有重組質粒pSK-PCV2 SD1、pMD18-T-PCV1的DH5α菌種，置于振蕩器中37℃ 200r/min搖菌12h。將菌液轉至離心管，質粒提取過程參照天根生化科技(北京)有限公司普通質粒小提試劑盒(離心柱型)說明書。（2）DNA的提?。杭尤?ml滅菌水溶解粉末狀偽狂犬病活疫苗，取偽狂犬活疫苗溶解液和豬細小病毒病滅活疫苗各500μl于1.5ml離心管。向離心管中加入10% SDS溶液50μl，而后加入蛋白酶K(20mg/ml)10ul，混勻后置55℃水浴1.5～2h；加入200μL Tris平衡酚，充分混勻溶液，置高速離心機中4℃12000rpm離心15min；取上清液于一新1.5ml離心管中，加入Tris平衡酚和氯仿各200μl，充分混勻，4℃ 12000rpm離心15min；取上清液于一新離心管中，加入氯仿200μl，充分混勻，4℃ 12000rpm離心15min；取上清液于一新離心管中，加入2倍上清液體積的已預冷的無水乙醇，于冰箱-20℃靜置20min后，4℃ 12000rpm離心15min，棄掉上清液，此時會發現管底附著有透明粘性沉淀。向離心管中加入1mL 70%乙醇沖洗沉淀表面和管壁，4℃ 7500rpm離心5min，棄掉乙醇，用吸水紙吸走余下液體；加入20μL滅菌水將沉淀溶解，置于-20℃保存備用。

1.4 引物設計與合成 根據GenBank上公布的多個PCV2毒株基因序列，以BioEdit軟件進行序列比對，篩選出序列JS2003(登錄號：AY578327)的ORF2片段作為靶基因，應用日本榮研株式會社的在線引物設計程序Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)，設計得到4條LAMP引物，包括1對外引物（F3/B3）和1對內引物(FIP/BIP)。P3、P4為實驗室常用PCR反應中擴增整個ORF2基因的上下游引物。所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 LAMP和PCR引物序列

1.5 LAMP檢測方法的建立與優化 通常LAMP方法使用25μL反應體系，成分包括：內外引物、dNTPs、MgSO4、Betaine、Bst DNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer、模板DNA。以LAMP原文中提到的反應體系為基礎，對各組分進行適當優化。內外引物濃度比按照10:1～1:1不斷調試，其中內引物終濃度范圍0.8～2.4μM，外引物終濃度范圍0.2～0.8μM；dNTPs終濃度范圍0.2～1.4mM；MgSO4終濃度范圍0～6mM；Betaine終濃度范圍0～1.4M；Bst DNA聚合酶8U、10×ThermoPol Buffer 2.5μl、模板DNA 1μl。反應溫度控制在60～65℃，擴增60min，80℃ 5min終止反應。取8μL擴增產物上樣于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，置凝膠成像系統下觀察結果。此外，還可向反應管中加入1μl SY BR Green I核酸染料，肉眼觀察溶液顏色變化，進一步確定結果，可將反應管置于紫外分析儀下觀察有無熒光。

1.6 PCR體系構成和擴增反應程序 以實驗室常用檢測PCV2的PCR方法來實現與LAMP檢測方法的對比，PCR方法也使用25μL反應體系，已經過前任研究者的優化。各成分終濃度分別是：上下游引物(P3、P4)0.4μM，dNTPs 0.2mM，1.5mM MgCl2，2.5U Taq DNA聚合酶，1×Taq Buffer with KCl。加入模板DNA 1μl，滅菌水補齊25μl。PCR擴增反應程序設定為：95℃ 3min，94℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共30個循環；最后72℃延伸10min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下分析結果。

1.7 LAMP檢測方法的靈敏性試驗 （1）梯度標準質粒模板的建立：① 分子量(M)=堿基數×堿基平均分子量=(擴增片段堿基數+載體堿基數)×2×330；②拷貝數=質量/分子量*NA= m/M*NA。制備質粒模板，用微量紫外分光光度計測定其濃度，計算出此濃度下溶液包含的質?？截悢担褂脺缇侗认♂屧撊芤?，得到每μl溶液所含質粒拷貝數的數量級按109～100依次分布的梯度標準質粒模板。（2）LAMP和PCR方法的靈敏度測定：以1μl拷貝數為109～100梯度標準質粒溶液為模板DNA，按照優化后的體系進行LAMP反應。同時，使用相同的模板DNA進行常規PCR檢測。兩者的擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，LAMP的擴增產物加入SYBR Green I核酸染料，置紫外分析儀下觀察結果。另外，提取臨床已知的58份病料的DNA，同時進行了LAMP和PCR方法的檢測，予以比較。

1.8 LAMP檢測方法的特異性試驗 提取到重組質粒pSK-PCV2-SD1、pMD18-T-PCV1，提取到兩種疫苗中的PRV和PPV基因組DNA。通過實驗室其他研究人員建立的，用于同時檢測PCV、PRV、PPV的多重PCR診斷方法來確定PRV和PPV作為對照可用。分別以質粒pSK-PCV2-SD1、pMD18-T-PCV1和驗證過含PRV、PPV的DNA為模板，滅菌水為陰性對照，采用優化后的體系來檢驗LAMP方法的特異性。擴增完成后，1.5%瓊脂糖凝膠中電泳確定結果。

2 結果

2.1 優化后的LAMP反應體系 LAMP優化完成的25μL反應體系中各成分最終濃度確定為：內引物(FIP/BIP) 2.4μM，外引物(F3/B3)0.24μM，dNTPs 0.6mM，Betaine 0.4M，Bst DNA聚合酶8U，1×ThermoPol Buffer(20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100)，模板DNA 1μl，添加滅菌水至25μl?？梢钥吹?×ThermoPol Buffer包含2mM的MgSO4，試驗證明在該體系下另外添加Mg2+后可導致擴增失敗。最佳反應條件是將反應管置63℃水浴60min，再放入80℃ 5min中止擴增。電泳分析可得知，當反應溫度在60～64℃范圍，均能呈現出明顯的LAMP特有的階梯狀條帶，表明擴增完成良好，其中尤以63℃條帶最亮；加入SYBR Green I核酸染料后，肉眼觀察可見陽性反應管內液體呈黃色，而陰性對照則為橙紅色；紫外燈下可見陽性反應管發出明亮的黃色熒光。

圖1 LAMP溫度梯度的電泳及可視化分析

2.2 LAMP檢測方法的靈敏度 （1）使用引物P3、P4的PCR方法擴增的靶序列包含PCV2基因組中整個ORF2，擴增片段大小717bp。靈敏度測試以含有109～100拷貝數的標準質粒溶液為模板DNA。電泳結果可見，PCR的條帶從第7泳道開始消失，而LAMP的階梯狀條帶直到第10泳道，也就是質粒模板僅為個位拷貝數時仍完成擴增。相比較而言，LAMP檢測方法的最低檢測量為100拷貝，質粒濃度約為0.01fg/μL；常規PCR檢測方法的最低檢測量為104拷貝，質粒濃度約為100fg/μL。同時檢測PCV2，LAMP方法的靈敏度相當于常規PCR法的10000倍。（2）對于臨床已知的58份病料的檢測情況為：PCR方法共檢測出12例陽性結果，而LAMP方法則檢測出了18例陽性結果，相比PCR方法能多檢測出6例陽性病料。在臨床檢測結果的確認方面還有不完善的地方，但應該能部分反映出LAMP方法的靈敏性確實比PCR要好一些。

圖2 LAMP檢測方法和PCR的靈敏度對比A: LAMP靈敏度的電泳及可視化分析；B: PCR靈敏度的電泳分析。M：DNA Marker DL-2000；1-10：每反應管內模板質?？截悢?0倍倍比縮小，依次從109-100；11：陰性對照。Lanes: M, DNA Marker DL-2000; 1, 1 × 109copies/tube; 2, 1 × 108copies/tube; 3, 1 × 107copies/tube; 4, 1 × 106copies/tube; 5, 1 × 105copies/tube; 6, 1 × 104copies/tube; 7, 1 × 103copies/tube; 8, 1 × 102copies/tube; 9, 1 × 101copies/tube; 10, 1 × 100copy/tube; 11, negative control.

2.3 LAMP檢測方法的特異性 PCV2、PRV、PPV是引起幾類主要豬病的重點DNA病毒，PCV1不具致病性，但由于與PCV2基因組之間存在較高的同源性，在檢測PCV2感染時必須能夠加以區分。電泳結果顯示，同等條件下，只有以重組質粒pSK-PCV2 SD1為模板的LAMP擴增產物呈現特有的階梯狀條帶。其余分別使用重組質粒pMD18-T-PCV1、PRV DNA、PPV DNA作為模板的反應結果均為陰性。說明該LAMP檢測方法對PCV2有良好的特異性。

圖3 LAMP檢測方法特異性試驗的電泳分析

3 討論

（1）豬圓環病毒包括PCV1和PCV2兩種基因型，PCV1并無致病性，而PCV2感染對養豬業來說卻是一個比較棘手的問題。Meehan等報道中提到PCV2各毒株間的核苷酸同源率達到96%以上，PCV1和PCV2之間的核苷酸同源率則小于80%[1-3]。以基因組中兩個較大的開放閱讀框ORF1和ORF2來看，兩者在ORF1的核苷酸同源率約為83%，相對地，兩者在ORF2的核苷酸同源率更小，約為67%[2-4]。試驗的目的是擴增只針對PCV2進行，選擇ORF2為靶基因設計的4條引物，從而取得了比較理想的結果。（2）試驗中發現，LAMP體系的優化與引物不同有關，同樣的體系在引物改變后有可能不會完成核酸擴增。因此，每當更換一組引物，體系配比最好重新摸索。如本試驗最終選定的這組引物所構成的體系，在MgSO4終濃度超過2mM時，便無法繼續完成核酸擴增。此外，擴增失敗的原因還與內外引物濃度比密切相關，就這組引物而言，當內引物濃度不大于2μM，外引物濃度不大于0.2μM時，只有當模板濃度較大時擴增才能發生。所以，前期不斷調試直到找到最佳反應體系，對于后續LAMP靈敏度和特異性方面的研究是至關重要的。（3）LAMP原理表明，當形成使核酸循環擴增的初始莖環結構后，多條內引物會同時與模板作用[5]，最終形成莖環數量不同的混合產物。因此經過凝膠電泳能呈現出LAMP特有的階梯狀條帶。在其他文獻中提到LAMP擴增過程中產生焦磷酸鎂，將反應管離心后能觀察到白色沉淀[6]。但本試驗發現，由于沉淀很難經由肉眼觀察，在沒有濁度儀的情況下，這種判別方式并不理想，當然也可能與該體系的Mg2+濃度偏低有關。除了通過凝膠電泳的方式判定結果外，還可向擴增產物中添加SYBR Green I核酸染料，本試驗中經常會出現陽性反應管內液體呈橘黃色而陰性管呈橘紅色的情況，所以相對于單純用肉眼觀察，將反應管置于紫外燈下觀察有無熒光會使精確度提高很多。

[1] Hamel AL, Lin LL, Nayar GP. Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs[J]. J Virol, 1998, 72(6):5262-5267.

[2] Meehan BM, McNeilly F, Todd D, et al. Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs[J]. J Gen Virol, 1998, 79(Pt 9):2171-2179.

[3] Morozov I, Sirinarumiter T, Sorden SD, et al. Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome[J]. J Clin Microbiol, 1998, 36(9):2-2541.

[4] Gibbs MJ, Weiller GF. Evidence that a plant virus switched hosts to infect a vertebrate and then recombined with a vertebrate-infecting virus[J]. Proc Natl Acad Sci USA , 1999, 96(14):8022-8027.

[5] Mori Y, Hirano T, Notomi T. Sequence specific visual detection of LAMP reactions by addition of cationic polymers [J]. BMC Biotechnol, 2006, 6:3.

[6] Enosawa M, Kageyama S, Sawai K, et al. Use of loop-mediated isothermal amplification of the IS900 sequence for rapid detection of cultured Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(9):4359-4365.

S852.65+9.2

A

1007-1733(2016)05-0009-03

2016–02–26）