豬化膿性鏈球菌的分離鑒定及耐藥性分析

趙明禮 （齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100）

豬化膿性鏈球菌的分離鑒定及耐藥性分析

趙明禮 （齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100）

本試驗利用山東某豬場發生臨床癥狀疑似鏈球菌疾病的豬，采集內臟器官(肝臟、脾臟)。通過菌落形態、鏡檢、生化實驗及PCR鑒定，篩選出1株化膿性鏈球菌，并進行了6種抗生素的藥敏試驗，發現分離菌株對四環素、克拉霉素、壯觀霉素和紅霉素有很強的耐藥性，對頭孢喹肟和青霉素高度敏感，敏感藥物是豬場防控豬化膿性鏈球菌的首選藥物。

豬化膿性鏈球菌 分離鑒定 藥敏試驗

豬化膿性鏈球菌病是由豬鏈球菌感染引起的一種常見傳染病，其危害日益嚴重。鏈球菌可引起豬的多種疾病，侵害各年齡段的豬只，通常以敗血癥、腦膜炎、關節炎、淋巴結炎為主要特征，人接觸病死豬可感染發病[1]。1998-1999年夏季中國江蘇省部分地區豬群中爆發鏈球菌病，導致相關人員感染致死；2005年中國四川再度爆發此疾病，同樣導致人員死亡的現象，給養殖業帶來了巨大的經濟損失的同時，嚴重危害人類的公共衛生安全[2]。

2015年11月中旬，山東某豬場發生個別的死亡現象，死前呼吸困難，沙啞，病死豬剖檢氣管有泡沫樣物質，肝臟腫大，呈土黃色，脾臟硬，稍腫大，心臟幾乎沒有太大的變化，腎臟正常，為了探討該豬場病因，進行實驗室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 該豬場病死豬的肝臟、脾臟等病變病料。

1.1.2 培養基 腦心浸液培養基，普通肉湯培養基等由市售商品；

1.1.3 生化試劑 乳糖、棉子糖、甘露醇、衛矛醇、水揚苷、山梨醇、精氨酸、七葉苷、木糖、蔗糖和葡萄糖，由杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器 電熱恒溫培養箱DRP-9162型(上海森信實驗儀器有限公司)、顯微鏡(NIKON公司)、恒溫搖床TH2-300(上海一恒科學儀器有限公)、潔凈工作臺SW-CJ-2FD型(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、梯度PCR儀S1000(北京金業德祥科技有限公司)、BG-Power600i型電泳儀(西安超杰生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養 在超凈工作臺下無菌挑取脾臟、肝臟病變部位，直接劃線接種于血平板上，置于37℃恒溫培養箱內培養18～24h，觀察結果。在血平板上挑取菌落，接種于腦心浸液培養基中，放入恒溫搖床內震蕩8～10h，吸取10ul的菌液分別進行涂片，再革蘭氏染色，鏡檢，觀察細菌的形態。

1.2.2 生化試驗 用已滅菌的接種環蘸取少量的細菌純培養液分別接于生化微量管：乳糖、棉子糖、甘露醇、衛矛醇等。置于37℃培養箱內培24h觀察結果。

1.2.3 PCR鑒定 （1）引物的設計與合成：根據GenBank中化膿性鏈球菌23sRNA基因序列設計擴增引物，F(上游)：5’-TGGAGGTAGAGCACTGTTTG-3’；R(下游)：5’-TTCTCACTTCTATGCGTTCC-3’，目的片段397bp，引物委托哈爾濱博仕生物有限公司合成。（2）細菌DNA的提取：按照細菌DNA提取試劑盒的使用說明來提取即可，-20℃保存。（3）PCR擴增：以提取的細菌DNA為模板，PCR反應體系50μl：DNA2μl，上引1μl，下引1μl，DNTP2.5μl，10×Buffer5μl，Tap酶1μl，ddH2O37.5μl；PCR反應條件：95℃預變性5min，94℃變性30″，52℃退火30″，72℃延伸30″，30個循環。（4）DNA瓊脂糖凝膠電泳：取10μl的PCR擴增產物在1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，120V，15min。以DNA Marker DL2000為標準分子量，在紫外燈下觀察電泳結果并照相。

1.2.4 藥敏試驗 應用WHO推薦的改良藥敏紙片擴散法（K-B法），按照NCCLS上的標準來做：先將純培養的菌液計數，然后稀釋到1～1.5×108cfu/ml。取100ul滴于普通肉湯瓊脂平板中，用已滅好的涂布棒涂勻，再用滅菌尖頭鑷子將藥敏片平鋪在肉湯瓊脂平板上，并且輕輕的壓緊，每個平板上貼5個藥敏片，藥敏片一旦接觸平板，就不能在移動。最后將貼紙片的平板底部在下，在37℃恒溫培養18h～24h，分析結果。

2 試驗結果

2.1 細菌的培養特性

經過37℃恒溫培養箱內培養24h后，在血平板上生長良好，呈溶血現象，中等大小，不透明，灰白色，圓形，中央隆起，邊緣整齊，光滑濕潤(圖1)。

圖1 分離菌在血平板上的菌落形態

2.2 鏡檢結果

在固體培養基上鏡檢為G+，短鏈(圖2)，在液體培養基上鏡檢為G+，長鏈(圖3)。

圖2 固體培養基上菌落的鏡檢結果

圖3 分離菌液的鏡檢結果

2.3 生化試驗結果

在恒溫培養箱內取出已接菌的生化微量鑒定管，根據顏色的變化，按照生化試驗結果判定標準來判斷(有的需要指示劑來進一步的判定)。

表1 分離菌株生化試驗結果

2.4 PCR鑒定結果

取PCR擴增產物5～8μl，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，120V，15min。在397bp處均擴增出目的片段，與陽性對照片段吻合(圖4)。

2.5 藥敏試驗結果

抑菌環的大小與1994年12月版的《美國NCCLS藥敏試驗紙片擴散法法規》做對比來分析判定藥敏試驗結果：

圖4 PCR擴增結果M：DNA Marker DL2000；1：分離菌株；2：陽性對照

表2 分離菌株藥敏試驗結果

3 討論

（1）根據臨床剖檢變化及生化試驗和PCR等實驗室診斷結果，可以初步鑒定引起豬場死亡的主要病原是化膿性鏈球菌，由于沒有做血清學分析，具體是哪個血清型還有待于進一步研究。（2）通過藥敏試驗可知，對頭孢喹肟和青霉素的敏感性較高，與毛劍虹等[3]報道相符，對大多數抗生素均有耐藥性，但對紅霉素等部分抗生素有很強的耐藥性，在國內董太明等[4]報道1993～1994年吉林、四川、廣州等地分離出376株化膿性鏈球菌中，對紅霉素耐藥率高達43.3%，香港地區報道2001～2002年耐藥率達32%[5]。藥敏試驗結果基本符合當前在大、中、小三種類型豬場對仔豬進行保健的藥物使用情況，目前保健藥物主要是頭孢類，目的主要是防控保育期的鏈球菌的發生。

4 結論

該豬場發病的主要病原為豬化膿性鏈球菌，并對病豬注射頭孢喹肟或青霉毒敏感性較高的藥物，其他豬至今沒有傷亡，得到了一定的控制。

[1] 王海麗, 趙德明, 葛長城等. 豬鏈球菌的分離鑒定及其生物學特性試驗[J]. 中國獸醫雜志, 2012,48(7): 36-39.

[2] 李彩英, 岳修偉, 侯怡軒等. 上海地區31株2型豬鏈球菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J]. 中國動物傳染病學報, 2011,19(6): 54-59.

[3] 毛劍虹, 呂火祥. 臨床分離化膿性鏈球菌的耐藥性分析[J]. 浙江醫學, 2008, 30(5): 483-484.

[4] 董太明, 蘇健, 黃震東等. 我國部分地區兒童A組鏈球菌耐藥性的研究[J]. 中華兒科雜志, 1999, 37(1): 35- 37.

[5] Ho PL, Johnson D R, Yue AWY, etal.Epidemiologic analysis of invasive and noninvasive group A streptococcal isolates in Hong Kong JC lin Microbiol, 2003, 41: 937-942.

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