比較兩種ELISA試劑盒在豬偽狂犬病血清抗體檢測中的一致性

全炎銘 賈澤穎 劉 鄧 郭又春 劉修權 劉莉如 伊秀春 陳華林

（北京三元集團畜牧獸醫總站，北京 100192）

比較兩種ELISA試劑盒在豬偽狂犬病血清抗體檢測中的一致性

全炎銘 賈澤穎 劉 鄧 郭又春 劉修權 劉莉如 伊秀春 陳華林

（北京三元集團畜牧獸醫總站，北京 100192）

比較兩種ELISA試劑盒檢測結果的一致性，為流行病學調查和臨床診斷篩選適合的商品化試劑盒。采用來自兩個廠家的野毒抗體 （gE）和免疫抗體 （gB）ELISA檢測試劑盒分別檢測362份和392份豬血清，應用Kappa檢驗比較試驗數據的一致性。結果顯示：兩種豬偽狂犬病抗體 （gE）檢測試劑盒聯合檢測出95份抗體陽性和256份陰性，符合率97.24%，結果一致性為極強 （Kappa值0.932）；兩種豬偽狂犬病抗體 （gB）檢測試劑盒聯合檢測出351份抗體陽性和9份陰性，符合率91.84%，一致性為弱 （Kappa值0.347）。以上結果說明，兩種豬偽狂犬病抗體 （gE）檢測試劑盒都適用于PRV gE抗體檢測，而兩種豬偽狂犬病抗體 （gB）檢測試劑盒差異較大，需慎重選擇。

豬偽狂犬病；ELISA試劑盒；比較；Kappa檢驗

偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一種急性傳染病，其特征為發熱、奇癢及腦膜炎癥狀[1-2]。該病曾得到很好的控制，但2011年至今，從北方向南方，PR疫情再次抬頭，席卷我國大部分地區，許多免疫過基因缺失苗的規模化陰性豬場瞬間轉陽，很多研究[3-6]表明此次大面積的豬場發病是由變異的PRV引起。雖然近期該病看似得到控制，很多野毒感染陽性穩定場很少發病，僅出現混合感染病例，但是在種豬場各個生長階段的豬群野毒感染的高陽性率，很大程度上影響了國內養豬業持續發展，增加了疫病防控的復雜性[7-9]，同時PR野毒感染率居高不下，存在疫情暴發的風險。因此，為了保證被檢豬群的安全性和加快陽性豬場的野毒凈化措施，有效開展野毒感染抗體與免疫抗體水平的跟蹤監測顯得十分重要[7-8]。

病毒抗體監測的方法較多，其中酶聯免疫吸附試驗（ELISA）具有客觀、敏感、特異、快捷等優點，為國際貿易中抗體檢測指定方法之一，目前已經廣泛運用于臨床診斷和血清學調查中[10-12]。本研究通過比較國內運用較為廣泛的兩種進口PR病毒野毒抗體gE和gB抗體ELISA檢測試劑盒，檢測樣本來源清晰的PR陽性豬場和陰性豬場血清，對其檢測結果的一致性進行評估和分析，為合理選擇診斷試劑盒提供參考。

1 材料與方法

1.1檢測樣品

豬血清采自9個不同的規模化豬場（陽性豬場3個，陰性豬場6個），為本實驗室保

存的秋季抽檢血清樣本。選取392份生長階段清晰的血清樣本進行免疫抗體檢測(除25～30日齡哺乳仔豬外，其他均免疫過PRV gE基因缺失弱毒苗)，再從這392份血清中剔除PR陰性場（A豬場）30份血清進行野毒抗體檢測。

1.2檢測試劑

ELISA進口試劑盒分別購買于美國愛德士（IDEXX）公司和西班牙海博萊（HIPRA）公司。PRV-gpI（gE）抗體檢測試劑盒：IDEXX（批號為99-09836 FM349），HIPRA（批號為 CAE.IM90）；gB抗體檢測試劑盒：IDEXX（批號為99-09732 EM176），HIPRA（批號為FS6397）。

1.3檢測方法及結果判定

豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測方法均按試劑盒說明書進行。IDEXX：讀取OD650值，用S/N值來判定結果（S/N=樣品OD值/陰性對照平均OD值），其中S/N≤0.6判為陽性，S/N＞0.7為陰性，0.6＜S/N≤0.7為可疑；HIPRA：讀取OD450值，采用IN%值判定（IN%=（陰性對照平均OD值-樣品OD值）/陰性對照平均OD值*100%），其中IN%＞45為陽性，IN%＜40為陰性，40≤IN%≤45為可疑。

豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測方法也按試劑盒說明書進行。IDEXX：讀取OD650值，用S/N值來判定結果，其中S/N≤0.5為陽性，S/N＞0.6為陰性，0.5＜S/N≤0.6為可疑；HIPRA：測定OD405值并計算S/P值，S/P= (樣品OD值-陰性對照平均OD值）/（陽性對照平均OD值-陰性對照平均OD值），其中S/P≥0.5為陽性，S/P＜0.5為陰性。

如有結果差異，選取兩試劑盒檢測結果不一致的血清樣本，再檢測1次，取2次平均OD值作為最終結果判定。

1.4統計學方法和判定指標

采用EXCEL處理數據，使用SPSS 19.0統計軟件對兩種試劑盒檢測結果進行分析。應用Kappa檢驗判定一致性，其中Kappa值＜0，提示一致性極差；Kappa值在0～0.2，表示一致性微弱；Kappa值在0.21～0.4，一致性弱；Kappa值在0.41～0.6，中度一致；Kappa值在0.61～0.80，較高一致性；Kappa值＞0.80，極強一致性。通過符合率、Kappa值等統計學指標，并結合送檢豬場流行病學情況綜合評價試驗檢測結果。

2 結果

2.1 Kappa檢驗比較豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測試劑盒

采用兩種試劑盒檢測結果見表1，總體樣品結果的符合率為97.24%。根據Kappa一致性檢驗，Kappa值為0.932，表明兩種試劑盒檢測結果有極強的一致性。

表1 兩種gE抗體試劑盒檢測結果一致性分析 （份）

兩種豬偽狂犬病病毒gpI（gE）抗體檢測結果顯示，362份樣品中有10份樣品結果不一致，分析發現這10份血清樣品的IDEXX檢測結果S/N值都是介于0.4～0.7之間，且分別來源于1份種公豬樣品（B033-1），1份哺乳仔豬樣品（B033-P5），1份母豬樣品（B036-8）和7份育成育肥豬樣品。不相符合豬血清樣品檢測結果見表2。

表2 兩種gE抗體試劑盒檢測不相符合血清樣品結果比較

2.2 Kappa檢驗比較豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測試劑盒

豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測試劑盒檢測結果見表3，總體樣品檢測結果的符合率為91.84%。Kappa值為0.347，判定結果為弱，表明兩種產品檢測結果存在較弱的一致性。

表3 兩種gB抗體試劑盒檢測結果一致性分析 （份）

兩種gB ELISA試劑盒檢測結果可見，392份豬血清樣品中，有33份樣品結果不一致，分析檢測差異主要集中在育成育肥豬群（中大豬），4份育仔豬。參考送檢豬場的送樣信息可看出,用這兩種試劑盒檢測PR陰性場和陽性場一部分中大豬血清樣品出現了明顯差異，見表4。

3 分析與討論

Kappa統計量是Cohen在1960年首先提出的一種旨在校正機遇可能后衡量一致性的方法，也是一種用于檢驗分類變量資料的一致性和重現性的統計指標[13]。具體而言，在研究工作中，可用來檢驗比較兩種檢查或測定方法結果的一致性，以及評估臨床診斷結果或調查結果的重現性問題[14]。近幾年來，該方法在檢驗醫學研究、流行病學及臨床資料可靠性考察衡量方面的應用越來越廣泛[14-16]，但在獸醫實驗室檢測中較少。隨著國家對一些重大動物疫病防控的高度重視，在強制免疫成為防疫的關鍵一環后，臨床診斷和抗體跟蹤監測顯得尤為重要，于是市面上很多獸醫臨床診斷試劑盒，如雨后春筍不斷涌現，可以應用Kappa一致性檢驗對其進行比較和評估[10-12,17]。

豬偽狂犬病的防治主要依靠疫苗接種和常規診斷檢測，豬PR病毒野毒抗體檢測采用gE抗體檢測試劑盒，診斷豬群是否感染豬偽狂犬病野毒株。PRV gE和gB抗體檢測試劑盒可用于PR診斷和該病的綜合防治及PR凈化效果的評估。本研究根據Kappa值為0.932這個判定指標，表明兩個廠家gE-ELISA試劑盒一致性極強，說明兩種試劑盒在血清學診斷和監測中差異不顯著，均可用于臨床個體樣本和群體野毒抗體檢測，這與楊濤等[17]報道的基本一致。

表4 兩種gB抗體試劑盒檢測不相符合血清樣品結果比較

在規模化豬場豬群PRV gE野毒抗體檢測的同時，采用gB抗體檢測試劑盒對豬群免疫后產生的抗體水平進行檢測，能更好地反映豬群PR防疫水平和抵制強毒感染的能力。通過我們對北京部分規模化養殖豬場PR的摸底排查和持續的跟蹤監測，了解到目前豬場普遍使用PRV gE基因缺失弱毒苗防控PR，近一兩年內出現很多PR陽性穩定場，全群受野毒侵蝕，后備豬群表現高的陽性率，是母豬群陽性率居高不下，其豬群中隱性感染的豬只隨之進入后備群，在豬場中形成循環感染，造成PR難以凈化的重要原因。但是出現的豬群免疫后持續性抗體水平（gB抗體高達95%以上）這種奇怪的現象引人深思，而本研究通過比較兩種gB抗體檢測試劑盒，檢測結果差異較大，一致性為弱，提示兩種試劑盒至少有一種結果不可靠，對兩者檢測結果存在差異的33份豬血清進行分析不難看出，主要集中在中大豬的檢測樣本中，HIPRA-gB ELISA結果檢出陰性，符合當前豬場中大豬群抗體低,容易感染的實際背景。表明不管是PR陰性場還是PR陽性場部分中大豬群免疫抗體水平低，加上衛生環境差，容易激發混合感染而發病，有必要加強育成育肥豬舍的日常消毒衛生和生物安全工作。因此建議在開展PR免疫后gB抗體檢測時，應根據實驗室檢測群體來源和檢測對象，慎重選擇不同的診斷試劑盒[10,12]。

當然，根據實際檢測樣本計算的Kappa值僅僅只是一個樣本的統計量，是反映一致性程度的數值[10]，體現兩種檢查方法或試劑檢測的一致性水平，可作為可靠性參考，但不是判定試劑盒或方法好壞優劣的唯一性指標，還需要參考敏感性、特異性和穩定性等指標[11-12]，以及抽樣誤差和實驗檢測中不可控的其他影響因素。

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S858.28

A

1673-4645(2016)12-0045-04

2016-12-04

三元種業自立課題（SYZY20130019）

全炎銘（1984-），湖南湘西人，碩士研究生，E-mail：26326109@qq.com