槐榆煎劑對(duì)肛腸手術(shù)后大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量的影響

劉雨燕， 許向前， 羅文昭

(河南省中醫(yī)院肛腸科，河南 鄭州 450002)

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槐榆煎劑對(duì)肛腸手術(shù)后大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量的影響

劉雨燕△， 許向前， 羅文昭

(河南省中醫(yī)院肛腸科，河南 鄭州 450002)

目的： 觀察槐榆煎劑對(duì)肛腸手術(shù)后大鼠血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量的影響，初步研究其作用機(jī)制。方法:40只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組以及槐榆煎劑低、高劑量組，每組10只，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量；HE染色法檢測(cè)肛周組織的病理學(xué)變化；Western blotting法檢測(cè)肛周組織中細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和NF-κB的蛋白表達(dá)。結(jié)果:給予槐榆煎劑干預(yù)后，可抑制肛腸手術(shù)后大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的升高與IL-10含量的降低，減輕大鼠肛周組織的水腫及充血程度，抑制肛腸手術(shù)后ICAM-1、VCAM-1和NF-κB蛋白表達(dá)的上調(diào)。結(jié)論:槐榆煎劑可調(diào)控血清中TNF-α、IL-6與IL-10的含量，并影響肛周組織中ICAM-1、VCAM-1和NF-κB的表達(dá)。

槐榆煎劑； 肛腸手術(shù)； 炎性細(xì)胞因子

肛腸手術(shù)后創(chuàng)口的炎癥反應(yīng)是肛門直腸疾病患者術(shù)后普遍存在的并發(fā)癥，可引發(fā)一系列次級(jí)癥狀，如排便困難或尿潴留等，給患者帶來諸多不便，影響手術(shù)效果及術(shù)后的恢復(fù)。我國(guó)肛腸疾病的發(fā)病率，女性約為67%，男性約為53.9%，各個(gè)年齡段均可發(fā)病，近年來發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)。

從槐榆煎劑(Huaiyu decoctum，HYD)的組方來看，槐花和地榆清熱解毒，涼血止血；芍藥、虎杖、蒲公英和白花蛇舌草清熱除濕，活血祛瘀，消諸瘡毒；當(dāng)歸、生地和茜草清熱滋陰，涼血止血。以上諸藥相合具有清熱涼血，止血消瘡毒的功效。國(guó)內(nèi)報(bào)道采用槐榆煎加減方治療內(nèi)痔出血，結(jié)果顯示槐榆煎對(duì)I期內(nèi)痔引起的出血的止血效果非常顯著[1]。本實(shí)驗(yàn)觀察槐榆煎劑對(duì)肛腸術(shù)后大鼠血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-10含量的影響，以及肛周組織細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和NF-κB蛋白表達(dá)的影響，探討槐榆煎劑對(duì)肛腸術(shù)后病理變化的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠，40只，雌雄各半，體重為(200±20)g，購(gòu)自南京君科生物工程有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為XYDS(滬)2013-0025，飼養(yǎng)于(23±2)℃室溫，自由飲食，雌雄分籠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 測(cè)定TNF-α、IL-6和IL-10的ELISA試劑盒購(gòu)自R&D；抗ICAM-1、VCAM-1和NF-κB抗體購(gòu)自Santa Cruz；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 槐榆煎劑組方 槐花、地榆、當(dāng)歸、生地各12 g，茜草、芍藥各9 g，虎杖、蒲公英各6 g，白及、白花蛇舌草、仙鶴草、荊芥穗各30 g，加水400 mL，加熱至沸，小火加熱1 h，水煎劑制成濃浸膏，參照人體用量，按系數(shù)折算出大鼠用量，加蒸餾水稀釋成灌胃溶液(含生藥200 g/L)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肛腸手術(shù)后模型的建立 用10%水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)，待大鼠麻醉后仰臥，用酒精將鼠尾近端擦拭消毒，待肛門松弛后，以肛緣為界，切開皮膚至直腸黏膜，切口為三角形，底寬約1.0 cm，高約2.0 cm(皮膚破損高約0.5 cm，黏膜破損高約1.5 cm)，造成皮膚黏膜組織損傷。

2.2 分組與給藥情況 將大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：正常對(duì)照(normal control)組給予正常飲食；模型(model)組于建模后當(dāng)天以5 mL生理鹽水灌胃；HYD低劑量組(HYD-low組)于建模后當(dāng)天給予5 mL灌胃溶液灌胃，每天1次，共給藥21 d；HYD高劑量組(HYD-high組)于建模后當(dāng)天灌胃5 mL灌胃溶液，每天2次，共給藥21 d。

2.3 標(biāo)本的采集 各組大鼠給藥完成后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，摘取眼球取血約5 mL，靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，收集上清液置于-20 ℃冰箱中保存。各組大鼠處死后，切除肛緣直至直腸粘膜處的組織，沖洗干凈，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 ELISA檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量 按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，將各組大鼠血清加入預(yù)包被抗NSE特異性抗體的酶標(biāo)板上，37 ℃溫育30 min，傾去液體，加入酶標(biāo)試劑50 μL，37 ℃溫育30 min，洗滌，加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL 顯色劑B，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，加入50 μL終止液，于450 nm波長(zhǎng)處酶標(biāo)儀讀數(shù)吸光度值(A)。

2.5 HE染色觀察肛周組織的病理變化 取各組大鼠肛周組織，用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，二甲苯I、II各5 min脫蠟，分別浸入梯度乙醇(100%，95%，80%，75%)，吸干水分，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，伊紅復(fù)染2 min，梯度乙醇脫水(95% 1 min×2次，100% 1 min×2次)，二甲苯透明，中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察。

2.6 Western blotting實(shí)驗(yàn) 取各組大鼠肛周組織，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集裂解液至離心管，離心后取上清液，用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白量。取適量裂解產(chǎn)物，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%的脫脂奶粉的TBST溶液，室溫放置1 h，加入相應(yīng) I 抗，4 ℃孵育過夜，洗滌，加入相對(duì)應(yīng)的 II 抗室溫孵育1 h，洗滌，加入ECL化學(xué)發(fā)光液孵育3 min，暗盒曝光，顯影沖洗，測(cè)定蛋白條帶的積分光密度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0計(jì)算軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。組間差異的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 槐榆煎劑對(duì)肛腸術(shù)后大鼠血清中TNF-α與IL-6含量水平的影響

如表1所示，模型組大鼠血清中的TNF-α與IL-6含量顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與模型組相比，HYD低劑量組和HYD高劑量組大鼠血清中的TNF-α與IL-6含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組明顯低于HYD低劑量組。

2 槐榆煎劑對(duì)肛腸術(shù)后大鼠血清中IL-10含量水平的影響

模型組大鼠血清中的IL-10含量明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與模型組相比，HYD低劑量組和HYD高劑量組大鼠血清中的IL-10含量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組明顯高于HYD低劑量組，見表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α與IL-6含量水平

Table 1.The content of TNF-α and IL-6 in serum of rats (ng/L. Mean±SD.n=10)

* P<0.05 vs normal control group; # P<0.05 vs model group.

3 各組大鼠肛周組織學(xué)觀察

正常對(duì)照組黏膜上皮和腺體排列整齊，未見水腫充血；模型組黏膜上皮和腺體大量缺失，黏膜下層血管充血，水腫；HYD低劑量組黏膜部分上皮和腺體缺失，黏膜下層水腫，血管充血，比模型組減輕；HYD高劑量組比HYD低劑量組病變減輕，黏膜上皮較完整，部分腺體缺失，黏膜下層水腫與充血程度減輕，見圖1。

Figure 1. The pathological changes of perianal tissue in each group with HE staining (×400).

圖1 各組大鼠肛周組織的HE染色結(jié)果

4 各組大鼠肛周組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)

如圖2所示，Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠肛周組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；給予槐榆煎劑處理后，ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組的蛋白表達(dá)降低幅度更大。

Figure 2. The protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 in the perianal tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsmodel group.

圖2 各組大鼠肛周組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)變化

5 各組大鼠肛周組織中NF-κB的蛋白表達(dá)

如圖3所示，Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠組織中NF-κB的蛋白表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；HYD低劑量組和HYD高劑量組組織中NF-κB蛋白表達(dá)顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組的NF-κB的蛋白表達(dá)低于低劑量組。

Figure 3. The protein expression of NF-κB in the perianal tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 各組大鼠肛周組織中NF-κB的蛋白表達(dá)變化

討 論

創(chuàng)傷或手術(shù)等造成組織的損傷，促使炎癥介質(zhì)釋放，激活外周傷害性感受器，信號(hào)傳導(dǎo)至下丘腦和大腦皮層，通過大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)信號(hào)的整合，使人產(chǎn)生痛覺[2]。國(guó)外學(xué)者[3]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)組織被破壞后，產(chǎn)生痛覺過敏介質(zhì)如TNF-α、IL-6和IL-10等炎性細(xì)胞因子，這些炎性細(xì)胞因子參與組織損傷后炎癥的調(diào)控，并增加疼痛的敏感性[4]。IL-6和IL-10作為術(shù)后創(chuàng)傷血清中炎性和抗炎因子，可作為術(shù)后炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈程度的檢測(cè)指標(biāo)[5]。TNF-α和IL-6屬于促炎細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在動(dòng)物模型中是致痛高敏物質(zhì)，將TNF-α注射至大鼠坐骨神經(jīng)軸突導(dǎo)致Aδ和C纖維自發(fā)放電異常，大鼠出現(xiàn)機(jī)械性痛覺過敏[6]。IL-6能夠刺激活化B細(xì)胞增殖，分泌抗體[7]。IL-10是一種活性較強(qiáng)的抗炎因子，能夠下調(diào)促炎因子受體的表達(dá)，并阻斷細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，保護(hù)脊髓神經(jīng)元，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。報(bào)道指出IL-10可抑制致炎致痛的炎癥介質(zhì)NO的合成與PEG2的產(chǎn)生，并通過抑制促炎細(xì)胞因子的釋放[8]，從而發(fā)揮止痛的作用。本研究發(fā)現(xiàn)槐榆煎劑能夠抑制肛腸病術(shù)引起大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的升高與IL-10含量的降低，同時(shí)HE染色顯示槐榆煎劑能夠改善肛周組織充血與水腫程度，推測(cè)槐榆煎劑通過降低肛腸術(shù)后促炎因子TNF-α和IL-6的含量，進(jìn)而抑制其致炎癥損傷的作用；提高抗炎因子IL-10的含量，從而降低肛腸病手術(shù)后疼痛，改善組織水腫充血的情況。槐榆煎劑可能通過抑制炎癥因子的含量，從而減少炎癥因子對(duì)外周的刺激減緩疼痛，此外，進(jìn)一步減少炎癥因子作用于脊髓背角神經(jīng)元NMDA受體與AMPA受體，減少神經(jīng)興奮性和中樞的敏感性，從而緩解組織對(duì)刺激的疼痛反應(yīng)。

黏附分子作為介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間，細(xì)胞與胞外基質(zhì)相互結(jié)合的細(xì)胞表面受體，主要參與細(xì)胞的識(shí)別、活化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在免疫應(yīng)答和炎癥發(fā)生等方面具有重要作用[9]。VCAM-1通過介導(dǎo)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞黏附至血管內(nèi)皮表面，促使白細(xì)胞往炎癥部位聚集，使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損。ICAM-1介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附，促使相關(guān)抗原陽(yáng)性白細(xì)胞黏附于ICAM-1陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞表面，進(jìn)一步到達(dá)炎癥組織，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的遷移和趨化[10]。NF-κB參與了許多與炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控，激活后增強(qiáng)各種前炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞黏附增強(qiáng)、炎性細(xì)胞趨化和細(xì)胞外基質(zhì)降解等[11]。ICAM-1與VCAM-1是NF-κB激活后的下游炎癥因子。本研究發(fā)現(xiàn)，槐榆煎劑在肛腸術(shù)后可通過抑制NF-κB通路從而減少黏膜ICAM-1與VCAM-1的表達(dá)，抑制白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，從而抑制炎癥反應(yīng)，通過抑制炎性細(xì)胞的遷移和趨化，減少炎性因子的刺激，從而緩解疼痛。

綜上所述，槐榆煎劑具有減緩肛腸術(shù)后的疼痛的作用，是通過調(diào)控炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量，抑制NF-κB通路，減少ICAM-1與VCAM-1的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)，減緩疼痛。

[1] 司紀(jì)廣. 槐榆煎加減治療內(nèi)痔出血的臨床觀察[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2015(6):32-33.

[2] 張莉莉， 王虎山， 姜長(zhǎng)林， 等. 注射用帕瑞昔布鈉超前鎮(zhèn)痛對(duì)開腹手術(shù)病人血清白介素-6的影響[J]. 按摩與康復(fù)醫(yī)學(xué), 2010, 1(3):6-7.

[3] Toussirot é. Biologics in spondyloarthritis: TNFα inhibitors and other agents[J]. Immunotherapy, 2015, 7(6):669-681.

[4] Esme H, Kesli R, Apiliogullari B, et al. Effects of flurbiprofen on CRP, TNF-α, IL-6, and postoperative pain of thoracotomy[J]. Int J Med Sci, 2011, 8(3):216-221.

[5] 石世堅(jiān)， 何忠承， 朱元蒿, 等. 地佐辛超前鎮(zhèn)痛對(duì)腹腔鏡肝切除術(shù)患者血清IL-6、IL-10及術(shù)后疼痛的影響[J].中外醫(yī)療，2014(21):86-88.

[6] Wei XH, Zang Y, Wu CY, et al. Peri-sciatic administration of recombinant rat TNF-alpha induces mechanical allodynia via upregulation of TNF-alpha in dorsal root ganglia and in spinal dorsal horn: the role of NF-kappa B pathway[J]. Exp Neurol, 2007, 205(2):471-484.

[7] 沈穎潔， 劉 喆. 手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激與炎性細(xì)胞因子的相關(guān)研究進(jìn)展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(11):75-77.

[8] Song XJ, Huang ZJ, Song WB, et al. Attenuation effect of spinal manipulation on neuropathic and postoperative pain through activating endogenous anti-inflammatory cytokine interleukin 10 in rat spinal cord[J]. J Manipulative Phy-siol Ther, 2016, 39(1):42-53.

[9] 楊 簡(jiǎn)， 楊 俊. 細(xì)胞黏附分子和動(dòng)脈粥樣硬化[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2006, 12(21):1307-1309.

[10]Kim SY, Ryu HM, Yang JH, et al. Matemal serum levels of VCAM-1, ICAM-1 and E-selectin in preeclampsia[J]. J Korean Med Sci, 2004, 19(5):688-692.

[11]Pueyo ME, Gonzalez W, Nicoletti A, et al. Angiotensin II stimulates endothelial vascular cell adhesion molecule-1 via nuclear factor-kappaB activation induced by intracellular oxidative stress[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20(3):645-651.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of Huaiyu decoctum on serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in rats after anorectal operation

LIU Yu-yan, XU Xiang-qian, LUO Wen-zhao

(DepartmentofProctology,HenanProvinceHospitalofTCM,Zhengzhou450002,China.E-mail:hnszyylyy@126.com)

AIM: To investigate the effects of Huaiyu decoctum on the serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in rats after anorectal operation. METHODS: Sprague-Dawley rats (n=40) were randomly divided into 4 groups: normal group, model group, low-dose Huaiyu decoctum group and high-dose Huaiyu decoctum group. The concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in the rat serum were measured by ELISA. The pathologic changes of the anorectal tissues were observed under microscope with HE staining. The protein expression of ICAM-1, VCAM-1 and NF-κB was determined by Western blotting. RESULTS: After Huaiyu decoctum administration, TNF-α and IL-6 concentrations in the serum were significantly decreased, and IL-10 concentration was increased as compared with model group. Moreover, Huaiyu decoctum markedly attenuated edema and hyperemia in the rats after anorectal operation. The protein expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and NF-κB in the anorectal tissues was obviously inhibited by Huaiyu decoctum treatment. CONCLUSION: Huaiyu decoctum improves the recovery of anorectal tissues after operation by decreasing the serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10, and reducing the protein expression of ICAM-1, VCAM-1 and NF-κB in the anorectal tissues.

Huaiyu decoctum; Anorectal operation; Inflammatory cytokines

1000- 4718(2016)11- 2091- 04

2016- 05- 23

2016- 08- 29

R259; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.030

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