糖尿病大鼠腎組織中PTEN/AKT/mTOR通路對自噬的調控作用*

吳德佩， 肖 瑛， 張瑩瑩， 曾令萍， 石明雋， 王圓圓， 郭 兵

(貴州醫科大學病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550025)

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糖尿病大鼠腎組織中PTEN/AKT/mTOR通路對自噬的調控作用*

吳德佩， 肖 瑛△， 張瑩瑩， 曾令萍， 石明雋， 王圓圓， 郭 兵

(貴州醫科大學病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550025)

目的： 觀察糖尿病大鼠腎組織中PTEN和自噬水平的變化，探討糖尿病腎病中PTEN/AKT/mTOR通路對自噬的調控機制。方法:將SD大鼠隨機分為正常對照組(NC組)和糖尿病組(DM組)，每組各8只。用鏈脲佐菌素復制DM大鼠模型。于成模后10周處死大鼠后測定相應生化指標和腎臟指數，免疫組化觀察腎小管上皮細胞PTEN蛋白的表達部位；Western blotting法檢測腎組織LC3、PTEN及PTEN/AKT/mTOR通路的變化；real-time PCR檢測腎組織PTEN的mRNA表達水平。結果:DM組的血糖、24 h尿蛋白量和腎臟指數均顯著高于NC組(P<0.05)。與NC組相比，DM組大鼠腎組織的LC3I和LC3II水平明顯降低(P<0.05)。PTEN主要分布于腎小管上皮細胞中，DM組PTEN蛋白的表達水平明顯低于NC組(P<0.05)。DM大鼠腎組織中，PTEN/AKT/mTOR通路的活性增高。結論:糖尿病大鼠腎臟組織中細胞自噬水平下降，而參與自噬調控的PTEN/AKT/mTOR通路活性升高，提示其自噬水平的變化可能受到PTEN/AKT/mTOR通路的調節。

自噬; 糖尿病腎病; PTEN/AKT/mTOR信號通路

糖尿病腎病(diabetic nephrapathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)嚴重的并發癥，也是導致終末期腎衰竭的常見原因[1]，其發病機制目前尚不清楚。自噬是細胞的自我吞噬過程，即細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和生物大分子物質，它可參與細胞的分化和發育，是一種高度保守的維持自身穩態的重要調節機制[2-3]。DN發生時腎組織中存在蛋白質損傷，而自噬途徑是細胞內損傷蛋白質清除的主要途徑之一。已有文獻報道，DN發生時自噬水平明顯降低[4]。第10號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)編碼具有脂質磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的雙重磷酸酶，它可以負性調控磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/AKT通路。本課題組前期研究結果顯示，在糖尿病大鼠腎臟中PTEN表達明顯減少，促進了腎纖維化的發生發展[5-6]。另有文獻報道PTEN可以調控自噬的變化水平[7]，但在DN中，PTEN的表達與自噬形成關系尚不明確，因此本研究擬采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)復制Ⅰ型糖尿病大鼠模型，通過多種分子生物學實驗方法檢測PTEN/AKT/mTOR通路對DM大鼠腎臟組織自噬水平的調控，以期為糖尿病腎病的防治提供新的理論與實驗依據。

材 料 和 方 法

1 動物

健康清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(160±20) g，購于北京華阜康生物科技有限公司，許可證號為[SCXK(京)2009-0004]。

2 主要試劑

STZ(購自Sigma)；兔抗大鼠PTEN單克隆抗體(Abcam)；兔抗大鼠LC3A/B抗體和兔抗大鼠p-mTOR(Ser2448)多克隆抗體(CST)；兔抗大鼠mTOR多克隆抗體(Proteintech)；兔抗大鼠AKT多克隆抗體和兔抗大鼠p-AKT(Thr308)多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG和辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(武漢普美克生物技術有限公司)；DAB顯色劑和免疫組織化學SP兩步法檢測試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜和Whatman 3MM濾紙(Millipore)；超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物研究所)；檸檬酸、檸檬酸三鈉、總RNA提取試劑盒以及PTEN和β-actin引物(上海生工生物技術工程服務有限公司)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)；2×SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)。

3 主要方法

3.1 動物模型的制備及分組 適應性喂養大鼠1周，造模前稱重，禁食6～8 h，采用乙醚麻醉，16只大鼠隨機分為正常對照組(normal control，NC組)和DM組，每組8只。DM組大鼠一次性尾靜脈注射溶于pH 4.5、0.01 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的鏈脲佐菌素，劑量為55 mg/kg； NC組大鼠予以尾靜脈注射等體積STZ溶媒枸櫞酸鈉緩沖液。注射后72 h，尾靜脈采血測空腹血糖，以血糖值大于或等于16.7 mmol/L為造模成功。

3.2 血、尿及腎組織采集 于實驗10周處死各組大鼠，處死前1 d用代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量，收集的尿液取部分離心后，取上清，于-20 ℃保存；處死前禁食6～8 h，麻醉后稱重，股動脈取血，分離血清，-20 ℃保存；開腹取雙側腎臟，去掉包膜及周圍脂肪組織，稱重后一部分用4%中性甲醛固定，其余放于-80 ℃保存。以腎重(mg)與體重(kg)的比值為腎臟指數(kidney index，KI)。

3.3 生化指標檢測 用氧化酶法測血糖(blood glucose，BG)，雙縮脲法測尿總蛋白(urine protein，UP)，以24 h尿量與尿蛋白濃度的乘積為24 h尿總蛋白量。

3.4 腎組織形態學觀察 用4%中性甲醛固定腎組織，經包埋、固定，然后行石蠟切片，HE染色后光鏡下觀察腎組織形態學變化。

The sun goes down without twilight, rain or snow will come next.

3.5 免疫組織化學染色 3 μm厚腎組織石蠟切片經微波修復抗原，采用SP法檢測PTEN(1∶100)在各組大鼠腎組織中的表達， I 抗4 ℃孵育過夜，同時以PBS作為陰性對照，取出室溫10 min，PBS沖洗，II 抗室溫孵育40 min，DAB染色，蘇木素復染，固定封片，脫水透明，晾干后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并攝取圖像。

3.6 Western blotting法檢測PTEN、AKT、p-AKT(Thr308)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)和LC3的蛋白水平 取大鼠腎皮質每 0.2 g用蛋白裂解液(按RIPA∶PMSF=100∶1的比例制備)1 mL，勻漿器研磨成液體，離心取上清測得蛋白含量，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyaerylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，然后以300 mA電轉移至PVDF膜上。5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜后分別加 I 抗β-actin(1∶4 000)、PTEN(1∶1 000)、AKT(1∶300)、p-AKT(Thr308)(1∶400)、mTOR(1∶500)、p-mTOR(Ser2448)(1∶600)和LC3(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；加II抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL試劑顯影曝光。LC3和PTEN以β-actin蛋白條帶作內參照；磷酸化p-AKT(Thr308)和p-mTOR(Ser2448)分別以總AKT及mTOR蛋白條帶作內參照，Bio-Rad凝膠成像系統掃描，Image Lab圖像分析軟件對每個條帶灰度進行定量分析。

3.7 Real-time PCR檢測PTEN的mRNA表達 TRIzol法提取總RNA；核酸蛋白分析儀測濃度及純度后，按Thermo逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA，通過Bio-Rad CFX96熒光定量PCR分析系統進行檢測，以β-actin為內參照，目的基因的相對含量以2-ΔΔCt表示，引物序列和退火溫度見表1。

表1 PCR引物序列及擴增條件

Table 1. The sequences and conditions of the primers used in real-time PCR

NameThesequencesoftheprimer(5'-3')AnnealingtemperaturePTENF:CAATGTTCAGTGGCG-GAACTT60℃R:GGCAATGGCTGAGG-GAACTβ-actinF:GCCAACACAGTGCTGTCT60℃R:AGGAGCAATGATCTT-GATCTT

F： forward; R: reverse.

4 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，所有實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較先進行正態性檢驗，再采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 兩組大鼠的腎臟指數、血糖和尿蛋白的變化

糖尿病組大鼠腎臟指數、血糖及24 h尿蛋白均顯著高于正常對照組(P<0.05)，結果見表2。

表2 正常組和糖尿病組大鼠血糖、腎臟指數和24 h尿蛋白量的變化

Table 2.The levels of kidney index (KI), blood glucose (BG), 24 h urine protein (24 h UP) in normal control (NC) group and diabetic (DM) group (Mean±SD.n=8)

*P<0.05 vs NC.

2 兩組大鼠腎臟組織的病理變化

HE染色可見正常大鼠腎小管結構清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，基底膜完整，間質中未見炎細胞浸潤。糖尿病組可見部分腎小管上皮細胞空泡變性，部分腎小管管腔擴張，間質有炎細胞浸潤，見圖1。

Figure 1. The histological changes of the renal tissues in the control and diabetic rats (HE staining, ×200).

圖1 正常組和糖尿病組大鼠腎組織的形態學觀察

3 糖尿病大鼠腎組織中自噬水平明顯下調

與正常對照組相比，糖尿病組LC3I蛋白的表達明顯降低(P<0.05)；與正常對照組相比，糖尿病組LC3II蛋白的表達也明顯降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The protein expression of LC3 in the control and diabetic rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC.

圖2 LC3在正常組和糖尿病組大鼠腎組織中的表達

4 糖尿病大鼠腎組織中PTEN表達明顯下調

免疫組化結果顯示正常對照組PTEN蛋白高表達于集合管和腎小管，腎間質及腎血管外膜也有少量表達，但糖尿病組大鼠腎組織PTEN的表達明顯減少,見圖3；通過Western blotting實驗檢測發現，糖尿病組大鼠腎皮質中的PTEN蛋白表達明顯降低(P<0.05)，real-time PCR結果顯示糖尿病組大鼠腎皮質PTEN的mRNA水平明顯低于正常對照組(P<0.05)，見圖4。

Figure 3. The expression of PTEN in the renal tissues of the control and diabetic rats detected by immunohistochemical staining (×200).

圖3 PTEN在正常組和糖尿病組大鼠腎組織中的表達

Figure 4.The expression of PTEN at mRNA and protein levels in the renal tissues of control group and diabetic group. A: Western blotting analysis for renal PTEN. The representative images of Western blotting shows 2 samples per group. β-actin was used for normalization to calculate the relative abundance of PTEN in control group and diabetic group. B: the graphical presentations show the relative abundance of PTEN mRNA in control group and diabetic group after normalization with β-actin. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC.

圖4 PTEN的蛋白和mRNA在正常組和糖尿病組大鼠腎組織中的表達

5 糖尿病大鼠腎組織中PTEN/AKT/mTOR通路相關蛋白水平的變化

與正常對照組相比，糖尿病組AKT蛋白的水平無明顯變化，而p-AKT(Thr308)蛋白明顯增多(P<0.01)；與正常對照組相比，糖尿病組的mTOR蛋白水平無顯著變化，而p-mTOR的蛋白水平顯著增高(P<0.01)，見圖5。

Figure 5. The protein levels of p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR in the renal tissues of control group and diabetic group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsNC.

圖5 正常組和糖尿病組大鼠腎組織中p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR的蛋白水平

討 論

自噬是一種溶酶體參與的、降解細胞內老化及受損的細胞器和蛋白質的細胞代謝過程，是應激狀態下細胞自我保護的適應性表現。自噬具有一定的細胞保護作用，在糖尿病腎病中，腎小管受損加重，會引起慢性腎功能衰竭的形成，而且自噬水平減弱；另有研究表明，高糖可誘導足細胞自噬的增強[8]，因此不同類型的自噬對細胞有著不同的病理生理意義。

mTOR信號通路是參與自噬的主要信號通路之一。近年研究發現，在結直腸癌中，自噬標志蛋白LC3的表達與mTOR的表達呈負相關，mTOR的失活誘導了自噬的激活[9]。目前在DN中，關于mTOR通路的研究甚少，且DN中自噬水平的高低與PTEN/AKT/mTOR通路之間的關系尚不明確。因此，本研究旨在觀察糖尿病大鼠腎臟組織中自噬相關蛋白LC3及PTEN/AKT/mTOR通路的變化，探討DN中自噬水平降低的可能機制。本課題組的前期研究發現，PTEN在糖尿病大鼠腎臟組織中表達下調[10]，在高糖培養的腎小管上皮細胞中，PTEN表達減少，而p-Akt蛋白水平上調[11]。但在DN中AKT與mTOR通路的關系尚不清楚。已有研究表明，抑癌基因PTEN可以負性調控PI3K/AKT通路，在此通路中，PI3K激活后使質膜上產生第二信使PIP3，PIP3與細胞內含有PH結構域的信號蛋白AKT和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)結合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Thr308位點導致AKT活化[12]。PTEN是一個PIP3磷酸酶，與PI3K的功能相反，它可以通過去磷酸化使PIP3轉變為PIP2，減少AKT的活化，進而阻止由AKT調控的下游信號傳導事件的發生。AKT又稱蛋白激酶B，是PI3K下游的主要效應物，它通過與下游多條信號通路相互作用進而調控細胞增殖、分化、凋亡、遷移等。mTOR信號通路是與AKT相互作用的信號轉導通路之一，活化的mTOR可以調控細胞生長、增殖、分化等過程，起著中心調控點的作用，該通路的失調與多種人類疾病相關，包括癌癥、糖尿病與心血管疾病[13-15]。mTORC2可磷酸化激活AKT，活化的AKT又可以激活mTORC1[16]，進而抑制自噬的變化水平，但在DN中，AKT與mTOR之間的相互關系還不是很清楚，所以有待深入研究。

本實驗采用免疫蛋白印跡檢測糖尿病組大鼠腎組織中自噬標志性蛋白LC3的表達明顯降低；免疫組織化學顯示PTEN主要分布于腎小管上皮細胞中；糖尿病大鼠腎組織中PTEN的蛋白和mRNA的表達水平均顯著降低；p-AKT和p-mTOR在糖尿病組大鼠腎組織中的蛋白水平均明顯高于正常對照組。因此推測DN中，PTEN/AKT/mTOR通路的過度激活可能介導了自噬的變化水平。但在本實驗中未做藥物干預研究，所以在后期實驗中可以給予藥物治療，檢測給予藥物干預前后糖尿病大鼠腎臟自噬水平的變化情況，以期為改善糖尿病腎病尋找新的靶點。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of PTEN/AKT/mTOR signalling pathway on regulation of autophagy in renal tissues of diabetic rats

WU De-pei, XIAO Ying, ZHANG Ying-ying, ZENG Ling-ping, SHI Ming-jun,WANG Yuan-yuan, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China.E-mail:yxhx20060725@126.com)

AIM: To observe the expression change of PTEN and autophagy in the renal tissues of diabetic rats, and to explore the regulatory mechanism of PTEN/AKT/mTOR pathway to autophagy in diabetic nephropathy. METHODS: The Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group and diabetic group (8 in each group). The diabetic rat model was established by injection of streptozotocin. The biochemical and kidney indexes were measured after the model of diabetic nephropathy was successfully established. The expression location of PTEN in the renal tubular epithelial cells was observed by the method of immunohistochemistry. The protein levels of autophagy-related protein LC3, PTEN and PTEN/AKT/mTOR signalling molecules were determined by Western blotting. The mRNA expression of PTEN was detected by real-time PCR. RESULTS: The blood glucose, 24 h urine protein and kidney index in diabetic group were all obviously higher than those in control group. Compared with control group, the protein levels of LC3I and LC3II in diabetic group were obviously decreased. PTEN was mainly located in the renal tubular epithelial cells. Compared with control group, the protein expression of PTEN was significantly down-regulated in diabetic group. Furthermore, the activity of PTEN/AKT/mTOR pathway increased in diabetic nephropathy rats. CONCLUSION: The level of autophagy in renal tissues of diabetic rats is decreased, whereas the activity of PTEN/AKT/mTOR pathway is increased. The level of autophagy may be mediated by PTEN/AKT/mTOR pathway.

Autophagy; Diabetic nephropathy; PTEN/AKT/mTOR signalling pathway

1000- 4718(2016)11- 2015- 05

2016- 05- 30

2016- 08- 06

國家自然科學基金資助項目(No.81360116)；貴州省科技廳基金資助項目(黔科合SY字[2013]3175號)；貴陽市科技局攻關項目(No. GY2015-31)

R587.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.016

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