云南省傣族、漢族人群乙型肝炎病毒感染與IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C的關聯性研究*

李婷婷， 張亞龍， 高建梅， 賀軍棟1, ， 嚴新民△

(1昆明理工大學醫學院，云南 昆明 650504；2云南省第一人民醫院，云南省臨床基礎醫學研究所，云南省出生缺陷與遺傳病研究重點實驗室，云南 昆明 650032)

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云南省傣族、漢族人群乙型肝炎病毒感染與IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C的關聯性研究*

李婷婷1, 2▲， 張亞龍1, 2▲， 高建梅2， 賀軍棟1, 2， 嚴新民2△

(1昆明理工大學醫學院，云南 昆明 650504；2云南省第一人民醫院，云南省臨床基礎醫學研究所，云南省出生缺陷與遺傳病研究重點實驗室，云南 昆明 650032)

目的： 探討云南省西雙版納地區傣族和漢族人群IL-6 -572C/G 和I型干擾素受體1(interferon alpha receptor 1，IFNAR1) -168G/C位點單核苷酸多態性與乙型肝炎病毒(HBV)感染后疾病轉歸的關聯性。方法:采集西雙版納州傣族、漢族人群血液樣本共600份，其中每個民族包括健康對照組100名、HBV感染患者200名(含100名自限性恢復患者和100名慢性乙肝患者)，運用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)和DNA測序技術對IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C位點進行基因分型。結果:傣族人群中，-572C/G位點基因型多態性與HBV感染后轉歸的關聯性并無統計學顯著性。C、G等位基因型在HBV感染組、正常對照組之間和慢性乙肝組、自限恢復組之間差異無統計學顯著性。但是在G顯性模式(GG+CG/CC)下，GG+CG基因型為HBV感染者發展成為慢性乙型肝炎患者的保護因素(P<0.05)。漢族人群中，-572C/G位點基因型和等位基因分布頻率在各組比較中無統計學顯著性，并且在G顯性模式和G隱性模式比較中也無統計學顯著性。在上述4種比較中，IFNAR1 -168G/C位點在漢族和傣族樣本中的差異均無統計學顯著性 。結論:IL-6 -572C/G位點GG+CG基因型可能是傣族人群中HBV感染者發展成為慢性乙型肝炎的保護因素，而IFNAR1 -168G/C多態性與HBV感染后轉歸在傣、漢兩族中并無顯著性關聯。

IL-6； 干擾素α受體1；基因多態性； 乙型肝炎病毒

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種常見的流行性感染病毒，在中國人群中感染率約占10%，因此對HBV的研究是一個亟需深入探索的課題。人體內與免疫相關的細胞因子位點上多態性的差異會影響其產量的高低，使宿主對HBV的免疫清除和殺傷效果差別較大，繼而導致個體轉歸的差異[1]。白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)位于染色體7p21處，由5個外顯子和4個內顯子及1個接近啟動子區域的序列組成[2]，是一種多功能性的免疫因子，在調控細胞的增殖和分化過程中扮演重要的作用。此外IL-6作為診斷肝癌的分子標記之一，而通常常見的肝癌發生是由于HBV感染的繼續惡化而轉歸所致[3]。IL-6基因多態性會影響IL-6 mRNA的表達，導致宿主體內IL-6產量的不同，繼而對HBV病毒的清除產生差別。干擾素α受體1(interferon alpha receptor 1，IFNAR1)是定位于21號染色體上的干擾素α受體的亞單位，其產物能特異性地與干擾素α結合[4-5]，從而使體內產生抗病毒蛋白，抑制乙肝病毒的復制。本文挑選的這2個細胞因子與機體免疫關聯很大，其產物能有助于對乙肝病毒的清除，影響患者疾病的轉歸。我們選取的是西雙版納地區傣族和漢族人群作為研究對象，運用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術和測序驗證對IL-6-572C/G、IFNAR1-168G/C位點進行檢測，并從流行遺傳病學的角度探討基因結構與HBV感染轉歸的關系。

材 料 和 方 法

1 研究對象

在知情同意的原則下，收集西雙版納州醫院漢族和傣族住院及門診乙肝感染患者和健康對照血樣各300份，其中漢族和傣族患者血樣各200份(自限性恢復組與慢性乙肝組各100人)，漢族和傣族健康對照組各100份。收集的血樣已確保3代以內無族外通婚，并且診斷標準參照2015年中華醫學會感染病學會及中華醫學會肝病學會修訂的《中國慢乙肝防治指南》分為正常對照組和乙肝病毒感染組，其中乙肝病毒感染組又可以根據病情的轉歸情況分為自限性恢復組和慢性乙型肝炎組，各組無其他疾病交叉感染記錄，研究對象的年齡、性別及肝功能指標分布見表1。

表1 研究對象年齡、性別及肝功能指標分布

TP other: TP<60 g/L and TP>80g/L; GLO other: GLO<20 g/L and GLO>35 g/L; ALT unit: U/L; AST unit：U/L.

2 方法

2.1 引物的設計與合成 用Gene Tool軟件設計引物并交與上海捷銳公司合成，引物序列見表2。

表2 SNP位點的PCR引物序列及反應條件

2.2 IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168C/G位點多態性分析 采用Sangon柱式基因組抽提試劑盒提取基因組DNA作為模版進行PCR擴增，體系為TaKaRa 2×Mix混合液12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL， DNA 1 μL，補足ddH2O 10.5 μL。反應完成后分別用的BsrB I和DdeI 37 ℃水浴酶切2 h處理。酶切體系為：9 μL ddH2O， TaKaRa 10×Smart Buffer 1.5 μL，BsrB I (DdeI) 0.5 μL， PCR DNA 4 μL。隨后進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳儀設定為120 V，25 min，膠濃度為1.5%，于凝膠成像儀觀察結果，隨機選取10%的樣本，采用ABI 3130測序儀進行DNA測序驗證酶切結果。

3 統計學處理

結 果

1 PCR-RFLP結果

IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C2個位點的3種基因型均有檢出，見圖1、2。

Figure 1.The cleavage map for the IL-6-572C/G site of the samples.M:marker.

圖1 樣本IL-6 -572C/G位點酶切圖

Figure 2.The cleavage map for the IFNAR1-168G/C site of the samples.M:marker.

圖2 樣本IFNAR1-168G/C位點酶切圖

2 測序驗證結果

IL-6 -572C/G位點多態性測序結果為GG/CG/CC(圖3)；IFNAR1-168G/C位點多態性測序結果為GG/GC/CC(圖4)。

Figure 3.The sequencing results for IL-6 -572C/G site. A: GG; B: CG; C: CC.

圖3 IL6-572C/G位點測序結果

Figure 4.The sequencing results for IFNAR1-168G/C site. A: GG; B: GC; C: CC

圖4 IFNAR1 -168G/C位點測序結果

3 基因多態性分析結果

經Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗，樣本中這2個位點基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，樣本具備代表性。本研究分為基因型頻率、等位基因分布頻率、隱性基因的顯性模式和隱性模式這4種分析方式在正常對照組、HBV感染組及慢性乙型肝炎組、自限性恢復組間進行比較，探尋差異是否具有統計學顯著性。由表3得知，傣族人群中，-572C/G位點基因型多態性與HBV感染后轉歸的關聯性并無統計學顯著性。C、G等位基因型在正常對照組、HBV感染組及慢性乙肝組、自限性恢復組間差異無統計學顯著性(表4)。在G顯性模式(GG+CG/CC)下，基因型GG+CG為傣族HBV感染者發展成為慢性乙肝的保護因素(P<0.05)，見表5。漢族人群中，-572C/G位點基因型、等位基因分布頻率在各組比較中差異無統計學顯著性，并且在G顯性模式和G隱性模式比較中差異也無統計學顯著性。在上述4種比較中，IFNAR1-168G/C位點在漢族和傣族樣本中差異均無統計學顯著性。綜上得出， GG+CG基因型為保護性因素，會降低傣族人群HBV感染后發展成為慢性乙型肝炎的風險，GG+CG基因型可能是傣族HBV感染人群發展成為慢性乙肝的保護性因素。

表3 傣族和漢族人群中IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C位點基因型和等位基因分布頻率

Group A: healthy control group; Group B: HBV infection group; Group C: spontaneous recovery group; Group D: chronic hepatitis B group.

表4 傣族和漢族人群中IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C位點等位基因分布頻率的比較

Group A: healthy control group; Group B: HBV infection group; Group C: spontaneous recovery group; Group D: chronic hepatitis B group.

表5 傣族和漢族人群中IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C位點的非條件logistic回歸模型分析

討 論

目前，單核苷酸多態性與HBV感染后轉歸的研究受到重視，相關的細胞因子多態性與HBV感染轉歸的研究基本已經涵蓋了已知的多數與免疫相關的細胞因子，如IL-6[3]、IL-10[6]、IL-28B[7]、TNF-α[8]、TGF-β[9]等。HBV進入機體受到T淋巴系統介導的對乙肝病毒的清除作用。在急性感染者中，T細胞比較活躍，能夠迅速清除機體內的HBV病毒；而在慢性感染者中，T細胞所產生的抗體反應較弱，對病毒的清除作用有限，故而使病人持續感染而導致肝損害。此外，乙肝病毒還受到機體免疫系統所產生的一系列免疫蛋白的殺傷效應，而其產量的高低受到啟動子區域特定位點的調控，因而對于該區域多態性的研究也是學者研究的重點。

HBV感染后轉歸的差異與人群有關，我們選取的研究對象是處于云南地區西雙版納傣族自治州醫院的樣本，由于地處邊疆、交通不便，傣族與其他民族語言、飲食和宗教信仰的差異，很少與其他民族通婚，形成了相對的種族隔離，因此可以作為一個很好的樣本來與漢族進行基因多態性與HBV感染差異性的研究。IL-6-572C/G基因多態性與HBV感染后轉歸的關聯在不同民族和地域的人群中差別較大，Lu等[10]以自限性恢復人群和慢性乙肝人群為樣本，得出-572C/G中GG基因型和G等位基因有助于HBV病毒的清除；而Tang等[11]研究得出，-572C/G多態性位點與慢性乙肝疾病的感染并無顯著的聯系。本文研究得出，在西雙版納州的傣族人群中，在基因型和等位基因分布上，-572C/G位點的多態性與HBV感染后轉歸的關聯并無統計學顯著性。在G顯性模式(GG+CG/CC)下，自限性恢復組和慢性乙肝組之間的差異有統計學顯著性，GG+CG基因型人群中慢性乙型肝炎發病風險顯著低于CC基因型人群，研究結果與Lu等[10]相同。

IFNAR1 -168G/C多態性在4號外顯子區域會發生Val(GTT)→Leu(CTT)轉變，繼而影響雌二醇羧化酶的活性[12]，雌二醇能抑制慢性HBV患者向原發性肝癌的轉歸，表現出雌二醇能抑制HBV的進一步發展[13]。Song等[14]在正常對照組、HBV感染組中(無癥狀感染組、急性肝炎組、慢性肝炎組、肝硬化組和肝癌組)比較得出顯著性差異，正常組中會有較高頻率的GTT基因型和較低的ALT濃度。但是我們研究得出，IFNAR1-168G/C突變在各對照組中并無顯著性差異，這可能與我們選取的人種遺傳背景的差異相關。本文研究結果顯示，IFNAR1-168G/C在傣族和漢族人群中，等位基因頻率分布、基因型頻率和C顯性模式和C隱性模式并無顯著性差異。

綜上所述，通過對IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C位點與傣、漢兩民族人群HBV感染后轉歸的研究發現，雖然在基因型和等位基因分布頻率上，IL-6-572C/G與傣族人群HBV感染后轉歸并無顯著性關聯，但是在G顯性模式分布中表明IL-6-572C/G突變中GG+CG基因型會減少傣族人群中HBV感染者發展成為慢性肝炎的風險，是一個保護因素；而IFNAR1-168G/C位點在傣族和漢族人群中在各組比較中分布頻率并無顯著性差異。臨床應用方面，通過采集長期注射恩替卡韋等核苷類藥物的HBV感染人群的血液，根據患者病情發展來驗證攜帶IL-6-C/G位點GG+CG基因型的患者是否有助于其康復，進而預測所使用藥物的治療情況，并希望能夠為患者提供及時的防治措施[15]，這也是我們工作的下一步目標。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Association between IL-6 -572C/G as well as IFNAR1 -168G/C and hepatitis B virus infection in populations of Dai and Han ethnicities in Yunnan Province

LI Ting-ting1, 2, ZHANG Ya-long1, 2, GAO Jian-mei2, HE Jun-dong1, 2, YAN Xin-min2

(1CollegeofMedicine,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650504,China;2YunnanInstituteofBasicMedicalSciences,ProvincialKeyLaboratoryforBirthDefectsandGeneticDiseases,TheFirstPeople’sHospitalofYunnanProvince,Kunming650032,China.E-mail:yxmin08@163.com)

AIM: To explore the association between IL-6 -572C/G (rs1800796) as well as interferon alpha receptor 1 (IFNAR1) -168G/C (rs2257167) and prognosis after hepatitis B virus (HBV) infection in populations of Dai and Han ethnicities in Yunnan Province. METHODS: The blood samples were collected from Dai people and Han people, each nation including 100 healthy controls and 200 infected individuals (100 spontaneous recovery individuals and 100 chronic patients). Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and DNA sequencing were used to identify the gene type. RESULTS: In Dai people, no significant difference was found between genetic polymorphism of -572C/G and prognosis after HBV infection. The differences of C and G alleles between spontaneous recovery group and chronic hepatitis B group, and healthy controls and HBV infection group were not statistically significant. Meanwhile, GG and CG genotypes were a vital protective factor for the person who developed into a chronic heptatitis B patient under the G allele dominance mode (GG+CG/CC) (P<0.05). In Han people, no statistically significance for IL-6 -572C/G genotype and allele distribution in each group comparisons had been found, as well as the C allele recessive mode and C allele dominance mode. For the above 4 indicators, no statistically significant difference of IFNAR1 -168C/G in Dai and Han people had been found. CONCLUSION: The GG+CG genotype of IL-6 -572C/G may be a protective factor for the HBV-infected Dai people to develop into chronic hepatitis B patients. However, there is no significant association between the IFNAR1 -168G/C polymorphism and prognosis after HBV infection in the 2 ethnicities.

IL-6; Interferon alpha receptor 1; Genetic polymorphism; Hepatitis B virus

1000- 4718(2016)11- 2056- 06

2016- 06- 15

2016- 09- 01

國家自然科學基金資助項目(No. 81360398)；云南省衛生科技計劃(No. 2014N269)；云南省教育廳科學研究基金項目(No. 2015J021);云南省科技計劃(No. 2013FB200)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.023

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△通訊作者 Tel: 0871-63638454； E-mail: yxmin08@163.com

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