TLR4/NF-κB在煙霧暴露大鼠肺血管重塑中的表達及意義*

王 萍， 曾玉蘭， 熊 瑋， 彭紅星

(華中科技大學附屬梨園醫院呼吸內科，湖北 武漢 430077)

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TLR4/NF-κB在煙霧暴露大鼠肺血管重塑中的表達及意義*

王 萍， 曾玉蘭△， 熊 瑋， 彭紅星

(華中科技大學附屬梨園醫院呼吸內科，湖北 武漢 430077)

目的：觀察煙霧暴露環境下肺血管Toll 樣受體4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)亞基P65蛋白和增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，探討TLR4及NF-κB信號通路在大鼠肺血管重塑中的可能作用機制。方法:SPF級健康雄性SD大鼠48只，隨機分為對照組(control組)、煙霧暴露4周組(S4組)、煙霧暴露8周組(S8組)和煙霧暴露12周組(S12組)，每組各12只。制備煙霧暴露大鼠模型，HE染色法觀察肺血管形態學變化，并測量各組大鼠肺血管管壁面積/血管總面積(WA%)和血管壁厚度/血管外徑(WT%)。免疫組織化學染色法檢測肺血管TLR4、P65和PCNA的表達，蛋白含量用平均積分吸光度來表示。RT-qPCR檢測肺血管TLR4的mRNA 表達，并分析各組肺血管WA%、WT%、TLR4蛋白和TLR4 mRNA、P65蛋白、PCNA蛋白與肺血管重塑的相關性及TLR4蛋白與WA%、WT%、P65蛋白、PCNA蛋白之間的相關性。結果:與對照組比，煙霧暴露組大鼠肺血管WA%及WT%都明顯增高，且WA%及WT%與煙霧暴露時間呈正相關關系(P<0.05)；煙霧暴露組肺血管TLR4蛋白、P65蛋白、PCNA蛋白和TLR4 mRNA的表達量較對照組比顯著增加，且與煙霧暴露時間呈正相關關系(P<0.05)。結論:煙霧暴露上調大鼠肺血管TLR4 蛋白的表達，TLR4和NF-κB P65蛋白的表達量與肺血管重塑程度呈正相關性。肺血管重塑可能與TLR4/NF-κB信號通路激活有關。

Toll樣受體4； 核因子-κB； 增殖細胞核抗原； 肺血管重塑

肺血管重塑是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、肺動脈高壓、肺纖維化等呼吸疾病的特征性病理改變，也是疾病發生發展中不可缺少的一個關鍵環節[1]，而肺血管平滑肌細胞異常增殖在血管重塑過程中起主導性作用[2]。煙霧暴露可通過炎癥反應，氧化應激，血管活性介質的調節，細胞內免疫應答通路的激活等途徑引起肺血管平滑肌細胞增殖，導致管壁增厚，管腔狹窄，血管管腔纖維化或完全閉塞[3]。研究表明Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)在肺組織血管內皮細胞及平滑肌細胞均有表達，TLR4及其信號通路核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)可能有促進肺血管重塑的發生[4]。而目前對TLR4的研究多集中在炎癥損傷，氣道高反應及氣道高分泌等方面[5-6]，對血管重塑研究較少有報道。為探討TLR4跟肺血管重塑的相關性，以及可能的發生機制，我們制備煙霧暴露大鼠肺血管重塑的模型，觀察不同煙霧暴露下大鼠肺部病理形態學和肺血管變化，檢測肺血管TLR4、NF-κB亞基P65和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達，從而來初步判斷肺血管TLR4、NF-κB P65和PCNA的表達與肺血管重塑的關系，為肺血管重塑的機制及靶向治療提供基礎實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

SPF級健康雄性SD大鼠48只，體重200～220 g(華中科技大學附屬梨園醫院老年醫學研究所動物實驗室飼養)；兔抗TLR4多克隆抗體、兔抗P65多克隆抗體、小鼠抗PCNA單克隆抗體均購自武漢谷歌生物公司；DAB顯色試劑盒(DAKO)；TRIzol試劑盒(Ambion)；Mix試劑盒、M-MLV逆轉錄酶試劑盒均購自Invitrogen。TLR4、β-actin引物由武漢谷歌生物公司合成；光學顯微鏡(Olympus)；實時定量PCR儀(TOYOBO)；N2分光光度計(上海精科)；HMIAS-2000彩色圖文分析系統(武漢千屏影像公司)。

2 方法

2.1 煙霧暴露模型制備及分組 參照許三林等[7]的方法制備大鼠被動吸煙裝置。煙熏箱大小為115 cm×65 cm×50 cm，每側各留9個直徑2.5 cm的通氣孔。被動吸煙實驗中，10支香煙捆扎為一組后點燃并置于煙熏箱中的支架上。利用CY-100B數字測氧儀監測煙熏箱中的氧濃度，并根其據監測結果調節煙熏箱通氣孔數，使煙熏箱中的氧濃度基本維持在20%～21%之間。每天吸煙2次，間隔4 h。

健康雄性大鼠48 只隨機分為:對照組(control組)，對照組大鼠置于小鋼絲籠內，除常規喂養外不做其他處理；煙霧暴露組分為4周組(S4組)、8周組(S8組)、12周組(S12組)，每組各12只。暴露組大鼠鋼絲籠于煙霧暴露時間內分別置于煙熏箱內，每天吸煙2次，每次吸煙10支，每次30 min，中間間隔4 h。香煙采用武漢市售紅金龍牌香煙，每支焦油含量為15 mg。

2.2 病理標本制作 各組大鼠造模完成后，用1%戊巴比妥鈉(90 mg/kg)麻醉實驗動物后處死，開胸，結扎右主支氣管，迅速取右肺，分離右肺動脈，凍存于-80 ℃冰箱，以備 RT-qPCR檢測用，左肺用 4%多聚甲醛經氣管充分灌注直至胸膜平整，結扎左主支氣管后剪下，放入4%的中性甲醛固定液，取材、脫水、石蠟包埋、切片，用于HE染色和免疫組織化學染色。

2.3 肺血管HE染色及病理學觀察 取厚度約為4 μm病理切片，用HE染色法進行染色，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺泡及肺血管的病理學變化，每張切片隨機選取斷面積較圓直徑為100～200 μm的肺動脈5支，用HMIAS-2000型醫學圖文分析系統對血管形態進行測量分析，測量血管的內徑，外徑，計算出血管壁厚度，血管壁面積及血管總面積，并記錄管壁面積/血管總面積(vascular wall area/total vascular area， WA%)和血管壁厚度/血管外徑(vascular wall thickness/vascular external diameter， WT%)。

2.4 免疫組織化學染色法檢測肺動脈TLR4、NF-κB P65和PCNA蛋白的表達 采用PV6000二步法免疫組化染色法，取厚度約4 μm病理切片，常規脫蠟后，滴加3%過氧化氫室溫孵育5～10 min，后嚴格按照試劑盒說明書分別滴加TLR4、P65和PCNA多克隆抗體進行染色顯色。數碼相機于400倍視野下隨機采集每張切片中5條直徑為100～200 μm的動脈圖像，用HMIAS-2000病理圖文分析系統進行定量分析，測定每個視野下陽性染色動脈的吸光度(A)，用平均積分吸光度(IA)來表示平均蛋白含量。

2.5 RT-qPCR檢測肺動脈TLR4的mRNA 表達 先嚴格按TRIzol試劑盒說明書步驟提取各組肺動脈總RNA，用分光光度計檢測，吸光度在1.8～2.0之間的用于實驗，按PCR反應試劑盒說明書進行反應，反應條件為95 ℃ 5 min； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s， 40個循環。最后由計算機自動計算并讀出各組Ct值，采用2-△△Ct法計算目的mRNA的含量。PCR引物序列見表1。

表1 引物序列及其產物大小

3 統計學處理

數據采用SPSS 13.0軟件進行分析處理。所有數據以均數±標準差(mean±SD)表示，各組間差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較用SNK-q檢驗。相關性分析采用Pearson法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HE染色結果

對照組肺部結構大致正常，肺泡較完整，肺動脈管腔較大，血管平滑肌較均勻，管壁較光滑，管壁及周圍較少炎性細胞浸潤。煙霧暴露組大鼠肺組織結構都有不同程度破壞，肺泡結構紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺血管都有不同程度增生，管壁增厚或管腔變形，管壁及周圍可見較多炎性細胞浸潤，以煙霧暴露12周組改變最為明顯，見圖1。

Figure 1.Pulmonary vascular manifestations of rats in each group with HE staining (×400).

圖1 各組大鼠肺動脈HE染色圖

煙霧暴露組肺血管重塑定量分析觀察指標(WA%和WT%)都明顯高于對照組，且跟煙霧暴露時間呈正比關系，各組間差異有統計學顯著性(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺血管形態學定量分析及TLR4蛋白、P65蛋白、PCNA蛋白和TLR4 mRNA的表達結果

Table 2.The quantitative analysis of the morphological changes, the protein expression of TLR4, P6 and PCNA, and the mRNA expression of TLR4 in the pulmonary vessels (Mean±SD.n=12)

Group WA%WT%TLR4P65PCNATLR4mRNAControl34.16±1.0822.18±1.220.28±0.090.16±0.030.25±0.041.00±0.12S447.75±0.91*40.45±1.09*0.34±0.07*0.27±0.02*0.32±0.05*1.31±0.23*S861.73±1.05*#51.56±1.38*#0.48±0.05*#0.32±0.05*#0.41±0.05*#1.57±0.21*#S1269.84±0.79*#△63.58±1.67*#△0.53±0.06*#△0.45±0.03*#△0.51±0.02*#△3.81±0.68*#△

WA%： vascular wall area/total vascular area； WT%： vascular wall thickness/vascular external diameter； TLR4: Toll-like receptor 4； P65： NF-κB subunit P65 protein； PCNA： proliferating cell nuclear antigen.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsS4 group;△P<0.05vsS8 group.

2 免疫組化方法檢測各組肺動脈TLR4、P65和PCNA的表達

TLR4位于胞質及胞膜，NF-κB P65位于胞核，PCNA也位于胞核，均以呈棕黃色顆粒為陽性表達。染色結果提示對照組肺動脈陽性染色較少，而隨著煙霧暴露時間增加，煙霧暴露組肺動脈染色加深，且以S12組最為顯著，見圖2。

煙霧暴露組肺血管的TLR4、P65和PCNA蛋白的IA值較對照組比均顯著增高，且S4、S8和S12組間，TLR4、P65、PCNA的蛋白水平隨煙霧暴露時間延長而增加，與煙霧暴露量呈正相關性，各組間差異有統計學顯著性(P<0.05)，見表2。

Figure 2.The protein expression of TLR4, P65 and PCNA in the pulmonary vascular tissues in each group (immunohistochemical staining, ×400).

圖2 免疫組化染色觀察各組大鼠肺血管TLR4、P65和PCNA蛋白的表達

3 各組大鼠肺動脈TLR4的mRNA表達

從表2可見，煙霧暴露組肺血管TLR4的mRNA表達量均明顯高于對照組，其表達量與煙霧暴露時間呈正相關性，各組間差異有統計學顯著性(P<0.05)。

討 論

肺血管重塑的機制目前仍不太明確，其病理生理實質也是血管的慢性炎癥反應[8]。吸煙、細菌感染等是引起肺部慢性炎癥和血管重塑的重要因素，其發生機制目前也還不是太明確。本實驗通過建立吸煙大鼠肺血管重塑模型，經HE染色觀察到煙霧暴露后各組大鼠肺血管都發生了不同程度的炎癥浸潤及管壁變形，增厚，管腔狹窄等，以吸煙12周組血管的改變最為明顯，且進一步通過計算證實血管重塑的客觀指標(WA%和WT%)與煙霧暴露時間呈正相關性，這與秦艷艷等[9]的實驗結果是一致的，提示煙霧暴露致使肺血管重塑大鼠模型制備成功，且肺血管重塑的程度隨煙霧暴露時間延長而逐漸加重。

TLR4在肺內肺外廣泛分布，參與調節細胞炎癥因子合成和分泌、調控機體免疫、識別和清除病毒等。近年來研究發現，TLR4還可能在血管重塑中起核心作用，NF-κB作為TLR4下游最為重要的轉錄子，在TLR4與受體結合后，TLR4/NF-κB信號通路激活，啟動血管炎癥反應[10]。唐曉敏等[11]發現TLR4通過激活NF-κB信號通路參與血管緊張素-II所致的高血壓大鼠的血管重塑；田剛等[12]發現COPD患者肺血管中TLR4及NF-κB水平明顯高于非COPD組，且發現其水平與肺血管壁周圍炎癥浸潤程度，肺血管平滑肌細胞增生程度都呈正相關性；Yang等[13]研究發現TLR4通過激活NF-κB信號通路，促進IL-1、IL-6、VEGF、BFGF等細胞因子的分泌與合成，促進肺動脈平滑肌細胞增殖，抑制其凋亡，導致肺動脈血管外膜，中膜及內膜增厚，管腔變形，加劇肺動脈高壓。

本實驗免疫組化和RT-qPCR結果提示，煙霧暴露組大鼠肺血管TLR4蛋白水平及TLR4的mRNA表達量明顯高于對照組，且隨煙霧暴露時間延長，S4、S8和S12各組間TLR4蛋白及mRNA表達都逐漸升高；而HE染色提示隨煙霧暴露時間延長，S4、S8和S12各組間肺血管重塑程度逐漸加重；肺血管重塑的客觀指標(WA%和WT%)與TLR4蛋白表達量趨勢一致。以上結果表明煙霧暴露可引起肺血管重塑，肺血管重塑程度與TLR4的mRNA和蛋白表達量變化有關。由此我們推測TLR4可能參與肺血管重塑。

免疫組化觀察還發現，煙霧暴露組大鼠肺血管P65蛋白水平明顯高于對照組，其表達量隨煙霧暴露時間延長而顯著增加；S4、S8、S12各組間，P65蛋白與TLR4蛋白的變化趨勢一致。以上結果表明NF-κB信號通路在肺血管重塑中存在，肺血管重塑可能與TLR4水平上調后NF-κB信號通路活化加強有關。平滑肌細胞增殖是肺血管重塑的重要病理特征之一，檢驗平滑肌細胞增殖是探索血管重構的一個敏感實用指標。本實驗通過檢測PCNA蛋白的表達，發現煙霧暴露組大鼠肺血管的PCNA蛋白水平顯著高于對照組，且隨煙霧暴露時間延長，S4、S8、S12各組間PCNA蛋白表達量也逐漸增加，其變化趨勢與肺血管重塑的程度呈一致性，與TLR4蛋白、P65蛋白的變化趨勢也呈一致性，相關性分析提示PCNA蛋白與TLR4蛋白亦呈正相關性。以上結果說明PCNA表達跟TLR4變化有關。韋江紅等[14]通過實驗證實PCNA的表達受TLR4/NF-κB信號通路調控，TLR4/NF-κB信號通路活化，PCNA蛋白表達增加，氣道平滑肌細胞增殖加速，凋亡抑制，支氣管哮喘大鼠的氣道重塑加重，TLR4/NF-κB不僅能誘導炎癥相關細胞因子的表達，而且還能調控肺動脈平滑肌細胞合成和分泌。這與我們的實驗結果一致。由此我們也推測肺血管PCNA的表達可能受TLR4/NF-κB信號通路調控，TLR4/NF-κB信號通路激活后，血管炎癥相關的細胞因子合成和分泌增加，通過細胞因子的相互作用及級聯生物學放大效應，導致肺血管平滑肌細胞增殖加速，肺血管重塑加重。

綜上所述，煙霧暴露大鼠肺血管TLR4蛋白表達增加，TLR4蛋白及NF-κB蛋白跟肺血管重塑程度呈正相關性，肺血管重塑可能與TLR4/ NF-κB信號通路激活有關。目前COPD及肺纖維化，肺動脈高壓等血管炎癥性肺部疾病發病率及死亡率還在逐年升高，研究血管重塑的可能機制，發現可能的作用靶點，如下調TLR4表達或尋找TLR4的拮抗劑對控制疾病的進程及提供有效的靶向治療有重要意義。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Expression and significance of TLR4/NF-κB in pulmonary vascular remodeling in smoking rats

WANG Ping, ZENG Yu-lan, XIONG Wei, PENG Hong-xing

(DepartmentofRespiratoryMedicine,LiyuanHospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430077,China.E-mail:zyldhdt@126.com)

AIM: To observe the expression of Toll-like receptor 4 (TLR4), nuclear factor-κB subunit P65 protein (NF-κB P65) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the pulmonary vascular tissues of the rats exposed to smoke, and to explore the possible mechanism of TLR4/NF-κB signaling pathway in pulmonary vascular remodeling. METHODS: SPF male healthy rats (n=48) were randomly divided into control group, smoke exposure for 4 weeks group (S4 group), smoke exposure for 8 weeks group (S8 group) and smoke exposure for 12 weeks group (S12 group), with 12 rats in each group. HE staining was used to observe the morphological changes of pulmonary vessels, and then the pulmonary vascular wall area/total vascular area (WA%) and vascular wall thickness/vascular external diameter (WT%) were measured by the medical image analysis system. The expression of TLR4, NF-κB P65 and PCNA in the pulmonary vascular tissues was detected by immunohistochemical staining. The protein content was expressed by the average integral absorbance. The mRNA expression of TLR4 in the pulmonary vessels was detected by RT-qPCR. The relationships between WA%, WT%,TLR4 protein, TLR4 mRNA, P65 protein, PCNA protein and pulmonary vascular remodeling, and another relationships between WA%, WT%, P65 protein, PCNA protein and TLR4 protein were analyzed.RESULTS: The WA% and WT% in smoke exposure groups significantly increased compared with control group, and the ratio was proportional to the time of smoke exposure. The protein expression of TLR4, p65 and PCNA, and the mRNA expression of TLR4 in smoke exposure groups also increased significantly compared with control group. CONCLUSION: The extent of pulmonary vascular remodeling in the rats increases when the protein expression of TLR4 is up-regulated. There is a positive correlation between pulmonary vascular remodeling and the protein expression of TLR4 and NF-κB P65. Pulmonary vascular remodeling may be related to the activation of TLR4/NF-κB signaling pathway.

Toll-like receptor 4; Nuclear factor-κB; Proliferating cell nuclear antigen; Pulmonary vascular remodeling

1000- 4718(2016)11- 2083- 05

2016- 06- 03

2016- 09- 13

華中科技大學自主創新基金資助項目(No.2015QN027)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.028

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