SENP3對大鼠成骨細胞端粒酶活性及端粒長度的影響

史素琴， 潘 研， 岳 新， 趙 璐

(河南中醫藥大學 1第一附屬醫院， 2中醫學博士后流動站, 第三附屬醫院博士后研發基地，河南 鄭州 450008)

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SENP3對大鼠成骨細胞端粒酶活性及端粒長度的影響

史素琴1， 潘 研1， 岳 新1， 趙 璐2△

(河南中醫藥大學1第一附屬醫院，2中醫學博士后流動站, 第三附屬醫院博士后研發基地，河南 鄭州 450008)

目的： 研究sentrin特異性蛋白酶3(SENP3)對大鼠成骨細胞端粒酶活性及端粒長度的影響。方法:首先0.2 mmol/L H2O2處理體外培養的大鼠成骨細胞后，Western blotting法檢測SENP3及特異性蛋白1(Sp1)的表達。pcDNA3.0-SENP3轉染成骨細胞，分別于24 h、48 h、72 h后采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞活力的變化。轉染48 h后，Western blotting法檢測Sp1和端粒酶逆轉錄酶(TERT)的表達，PCR-TRAP法及PCR法檢測端粒酶活性及端粒長度；ELISA檢測上清中堿性磷酸酶(ALP)和骨橋蛋白(OPN)的含量；放射免疫法(RIA)檢測骨鈣蛋白(OCN)的含量。最后將pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1共轉染成骨細胞，并檢測以上指標。結果:H2O2處理成骨細胞后，SENP3和Sp1的表達顯著上升。pcDNA3.0-SENP3轉染成骨細胞后，Sp1和TERT的表達顯著上升，細胞活力、ALP、OPN及OCN含量也都顯著上升；端粒酶活性顯著增加及端粒長度縮短顯著延緩。而當pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1共轉染成骨細胞后，細胞活力，ALP、OPN及OCN含量，端粒酶活性及端粒長度均未發生顯著變化。結論:SENP1通過上調Sp1的表達促進TERT的表達，增加端粒酶活性上升及延緩端粒長度縮短，從而增強成骨細胞增殖能力。

Sentrin特異性蛋白酶3； 特異性蛋白1； 端粒酶逆轉錄酶； 成骨細胞； 端粒酶

成骨-破骨細胞在維持骨重建平衡中發揮重要的作用[1]，正常情況下，二者保持平衡，但隨著年齡的增長，成骨細胞的活性會隨之降低，導致骨吸收大于骨形成，骨密度降低，最終形成骨質疏松[2]。由此可見，骨質疏松與衰老有一定的關系，而端粒酶在衰老過程中發揮重要的作用[3]。

端粒是染色體末端的一段富含G的DNA重復序列，在復制分裂過程中會逐漸丟失堿基對，導致端粒逐漸縮短，細胞發生老化。端粒酶(telomerase)則由端粒酶相關蛋白1(telomerase-associated protein 1，TEP1)、端粒酶RNA(telomerase RNA)和端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)組成，其中，TERT對端粒酶活性起著限速作用。

Sentrin特異性蛋白酶3(sentrin-specific protease 3，SENP3)是介導去小泛素樣修飾物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)化修飾的酶家族成員之一，主要功能是催化底物蛋白去除SUMO2/3，并進一步調節蛋白質的活性，尤其是對細胞內轉錄因子的調控[4]。研究報道，輕度的氧化應激條件下，SENP3蛋白水平即可顯著增加，而且可通過去除轉錄因子特異性蛋白1(specificity protein 1, Sp1)的SUMO2/3修飾，進而增加Sp1的活性[5-7]；而Sp1可以激活人TERT基因的表達，提高端粒酶活性，增加端粒長度[8]，起到抗衰老的作用。在骨質疏松的發生發展過程中常伴有氧化應激的發生，氧化應激可抑制成骨細胞分化，抑制成骨細胞的礦化作用。因此，本文旨在探索SENP3是否可通過影響Sp1的活性，進而在骨質疏松中發揮抗衰老的作用，以期為治療骨質疏松提供新的藥物靶點及策略。

材 料 和 方 法

1 動物

24 h內新生的SD大鼠15只，購買于南京君科生物工程有限公司，合格證號為SCXK(滬)2013-0016。

2 主要試劑及材料

透明質酸酶、I型膠原酶、DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、β-甘油磷酸鈉、MTT和telomerase檢測試劑盒均購于Sigma；巴比妥納購于上海恒遠生化試劑有限公司； H2O2購于上海譜振生物科技有限公司；Lipofectamine 2000購于Thermo Fisher；SENP3、Sp1、TERT等I抗購于Abcam；PVDF膜購于Millipore；脫脂奶粉購于南京生興生物技術有限公司；ECL發光液購于碧云天生物技術有限公司；骨鈣素放射免疫分析試劑盒購于上海研晶生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 成骨細胞的分離及培養 將出生24 h內的大鼠拉頸處死，用75%的乙醇消毒5 mim后，取其顱蓋骨放入PBS中進行清洗，然后去除骨表面被膜和軟組織，并將骨片剪成(1～3) mm×1 mm×1 mm大小，加入0.2% I型膠原酶和0.1%透明質酸酶進行消化，總共消化5次，每次20 min；收集第5次消化后的細胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞，并接種于培養瓶中，于37 ℃、5% CO2的培養箱中進行培養，24 h后換液，待細胞鋪滿至80%時，加入0.25%的胰酶進行消化，即為原代成骨細胞，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

3.2 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色法鑒定成骨細胞 將無菌的玻片放入培養瓶中，傳代時加入適量的細胞懸液，待細胞長滿玻片后取出。用PBS沖洗后加入冷丙醇固定10 min，蒸餾水沖洗多次；將其放入現配的ALP孵育液(3% β-甘油磷酸鈉5 mL，2%巴比妥納5 mL，2% CaCl210 mL，2% MgSO41 mL，蒸餾水10 mL)中，于37 ℃孵育4～6 h；蒸餾水清洗數次后，在2%硝酸鈷中浸泡3～5 min，蒸餾水清洗；再置于1%硫化銨中2 min，蒸餾水清洗，晾干，封固，于光鏡下觀察。

3.3 H2O2處理成骨細胞誘導氧化應激狀態 將對數期生長的成骨細胞，用0.25%胰酶消化后，加入終濃度為0.2 mmol/L 的H2O2，繼續培養24 h誘導氧化應激狀態，并用于后續實驗。

3.4 重組pcDNA3.0-SENP3載體轉染成骨細胞 重組pcDNA3.0-SENP3質粒由輝駿生物科技有限公司構建。所用細胞為H2O2處理細胞。實驗分為pcDNA3.0-SENP3轉染組、pcDNA3.0空載轉染組(pcDNA3.0 vector組)和未轉染組[即空白對照(blank control, BC)組]。將培養的成骨細胞以每孔1×106接種于6孔培養板中，待其長滿后取出。吸取鑒定后的pcDNA3.0-SENP3質粒20 μL，Lipofectamine 2000 100 μL，不含胎牛血清的DMEM培養基1 mL，均勻混合后，室溫下靜置15 min。然后將質粒、脂質體混合物轉移到培養瓶中，每孔300 μL，再將其放入37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養，未轉染組則加入等量的DMEM培養液，每組均重復3孔，并設置3次獨立重復試驗。

3.5 pcDNA3.0-SENP3 與Sp1-siRNA共轉染成骨細胞 重組Sp1-siRNA由輝駿生物科技有限公司構建合成。所用細胞為H2O2處理細胞。實驗分為未轉染組(即BC組)、pcDNA3.0-SENP3+Sp1-siRNA轉染組(pcDNA-SENP3+si-Sp1)和只加轉染試劑組(mock組)，將培養的成骨細胞以每孔1×106接種于6孔培養板中，待其長滿后取出。吸取鑒定后的pcDNA3.1-SENP3質粒及Sp1-siRNA質粒共20 μL，Lipofectamine 2000 100 μL，不含胎牛血清的DMEM培養基1 mL，均勻混合后，室溫下靜置15 min。然后將質粒、脂質體混合物轉移到培養瓶中，每孔300 μL，再將其放入37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養，未轉染組則加入等量的DMEM培養液，每組均重復3孔，并設置3次獨立重復實驗。

3.6 Western blotting實驗 按照3.4與3.5步驟中所述各組進行轉染，48 h后，將細胞于冰上放置30 min，12 000 ×g離心10 min。將30 mg總蛋白加入到10% 的SDS-PAGE凝膠中進行電泳，再將蛋白轉至PVDF膜上，經5% 脫脂奶粉封閉后，加入相應的 I 抗(SENP3、Sp1和TERT)于4 ℃孵育過夜，然后加II抗室溫孵育1 h后，利用ECL液顯影，掃描儀成像。

3.7 MTT法檢測細胞活力 取對數期生長的細胞(H2O2處理)，以1×106/L的濃度接種于96孔培養板中，每孔200 μL，按照3.4和3.5步驟中所述各組進行轉染。每組均重復5個孔，并進行獨立重復實驗3次。分別于轉染后的24、48和72 h后向各孔加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h后，棄掉上清后加入150 μL的DMSO，于酶標儀490 nm處測吸光度(A)值。

3.8 TRAP-PCR法檢測端粒酶活性 按照3.4與3.5中所述轉染細胞48 h后，分別收集細胞。嚴格按照TRAP-PCR試劑盒說明書進行操作。先提取細胞端粒酶，然后進行PCR擴增，再進行聚丙烯酰氨凝膠電泳，最后銀染，用Fragment Manager凝膠分析儀進行分析。

3.9 PCR法測定端粒長度 按照3.4與3.5所述轉染細胞48 h后，提取細胞總DNA，按照李杰華等[9]所述進行操作。上游引物序列為5’-TTAGGG-3’，下游引物為5’-CCCTAA-3’。反應程序為：94 ℃ 50 s， 55 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30 個循環；72 ℃ 10 min。反應完后，向45 μL PCR產物中加入90 μL 無水乙醇，28 μL 乙酸銨，放于-20 ℃冰箱反應20 min后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，去掉上清，加入50 μL TE緩沖液溶解沉淀，然后加入滅菌的雙蒸水到200 μL，最后于260 nm處測定紫外吸收值，進行定量分析。

3.10 ELISA法檢測ALP和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的含量 ALP和OPN的檢測按照其相應的ELISA試劑盒說明書進行操作。

3.11 放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)檢測骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)含量 按照3.4與3.5中所述進行轉染，48 h后收集各組細胞，按照[125I]OCN放射免疫分析試劑盒說明書進行操作。

4 統計學處理

數據采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，所有數據均以均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間均數比較采用Student’st檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 成骨細胞的鑒定

倒置顯微鏡下觀察成骨細胞，顯示細胞大多數呈梭形，有突起；ALP染色可見細胞中有灰黑色顆粒狀或塊狀沉淀，胞質染色較為明顯，見圖1。

Figure 1.Identification of osteoblasts (×200). A: the osteoblasts were observed under inverted microscope; B: the osteoblasts were identified using ALP staining.

圖1 成骨細胞的鑒定圖

2 H2O2處理成骨細胞后對SENP3和Sp1表達的影響

首先，我們用H2O2處理成骨細胞，利用Western blotting法檢測輕度氧化應激狀態下成骨細胞中SENP3和Sp1的表達。結果顯示與對照組相比較，H2O2處理后SENP3和Sp1的表達都顯著上升(P<0.05)，見圖2。

3 過表達SENP3對成骨細胞活力的影響

用MTT實驗檢測過表達SENP3后對成骨細胞活力的影響。結果顯示與對照組相比較，成骨細胞轉染SENP3 24 h、48 h及72 h后，細胞活力顯著上升(P<0.05)，見圖3。

4 過表達SENP3對ALP、OCN和OPN含量的影響

與對照組相比較，過表達SENP3 48 h后，成骨細胞的ALP、OCN及OPN的含量顯著上升(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.The effect of H2O2on the protein expression of SENP3 and Sp1 in the osteoblasts determined by Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control (BC).

圖2 Western blotting法檢測H2O2對成骨細胞中SENP3和Sp1表達的影響

5 過表達SENP3對Sp1和TERT表達的影響

與對照組相比較，將過表達載體pcDNA3.0-SENP3轉染到成骨細胞后 Sp1和TERT的表達顯著上升(P<0.05)，見圖5。

Figure 3.The effect of overexpression of SENP3 on the viability of osteoblasts measured by MTT assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsblank control (BC).

圖3 MTT法測定過表達SENP3對成骨細胞活力的影響

Figure 4.The effects of overexpression of SENP3 on the concentrations of ALP, OCN and OPN in the osteoblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control (BC).

圖4 過表達SENP3對成骨細胞中ALP、OCN以及OPN含量的影響

Figure 5.The effects of overexpression of SENP3 on the expression of Sp1 and TERT in the osteoblasts determined by Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control (BC).

圖5 Western blotting法檢測成骨細胞過表達SENP3對Sp1和TERT表達的影響

6 過表達SENP3對端粒酶活性及端粒長度的影響

與對照組相比較，過表達SENP3后端粒酶活性顯著上升(P<0.05)，為對照組的1.90倍；端粒長度縮短顯著延緩(P<0.05)，為對照組的2.04倍，見圖6。

7 共轉染pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1對成骨細胞的影響

為了研究SENP3是否是通過促進Sp1的表達，進而增加端粒酶活性及端粒長度，我們將pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1共轉染成骨細胞，結果發現，與對照組相比較，共轉染pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1后，細胞活力變化的差異無統計學顯著性,ALP、OCN及OPN的含量,Sp1與TERT的表達,端粒酶活性及端粒長度也無明顯變化，見圖7。

討 論

成骨能力下降而骨吸收加快是骨質疏松的主要病理基礎，成骨細胞的增生和產生新生骨質又是骨折愈合的基礎，因此，促進成骨細胞增殖，改善成骨細胞功能對治療骨質疏松具有重要的意義[10-11]。

Figure 6.The effects of overexpression of SENP3 on the activity of telomerase and the length of telomere in the osteoblasts. A: the activity of telomerase was measured by TRAP-PCR; B: the length of telomere was measured by PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control (BC).

圖6 成骨細胞過表達SENP3對端粒酶活性及端粒長度的影響

Figure 7.siRNA-Sp1 (si-Sp1) reversed the effect of pcDNA3.0-SENP3 (pcDNA-SENP3) on the osteoblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control (BC).

圖7 siRNA-Sp1可反轉pcDNA3.0-SENP3對成骨細胞的作用

SENP3為SUMO化特異性蛋白酶家族成員之一，已有研究證明，在氧化應激狀態下，SENP3的表達顯著上升[12]，而且與細胞增殖相關，如SENP3在氧化應激狀態下不但可促進人臍靜脈內皮細胞、小鼠胚胎成纖維細胞和HeLa細胞增殖，而且還可以促進前骨髓細胞癌細胞的增殖[13]；本文研究結果也表明，成骨細胞在輕度氧化應激狀態下，SENP3的表達顯著升高，而且，過表達SENP3后可顯著增強成骨細胞的活力，成骨細胞標志蛋白ALP、OCN及OPN含量也顯著上升；而對照組細胞活性較小，可能因為其細胞分化程度較低，與前研究結果一致，如張永青[14]成功分離培養出1日齡大鼠的成骨細胞，經不同濃度黃芪甲苷處理后，其可顯著促進成骨細胞的增殖，而對照組則相對較低。可見，SENP3可通過促進成骨細胞的活性，進而在骨質疏松中發揮一定的作用。

衰老是骨質疏松癥的一個重要病因，而在這一過程中，常伴隨著端粒的丟失，端粒酶活性的下降，端粒酶活性卻主要依賴于TERT的表達水平。如Yudoh等[15]將人TERT基因轉染到人成骨細胞NHOst 54881中后可顯著增加端粒酶活性。芮鋼等[16]將hTERT穩定轉染到成骨細胞中，能顯著增加成骨細胞的壽命，防治細胞老化并保持成骨細胞的功能特性。因此，對端粒酶活性的研究已成為抗骨質疏松的熱點。Sp1是一種含鋅指結構的轉錄因子，且研究證明Sp1參與調控了TERT的表達，如Sp1可增加皮膚角化細胞中hTERT的表達和端粒酶活性[8]；而在輕度的氧化應激狀態下，SENP3又可促進Sp1的表達[5-6]，本文研究結果也表明，H2O2處理成骨細胞后，過表達SENP3，Sp1的表達顯著上升，其次，端粒酶活性顯著增加及端粒長度縮短延緩；而當pcDNA3.0-SENP3與siRNA-Sp1共同轉染成骨細胞后，結果顯示細胞活力、成骨細胞標志蛋白含量、Sp1的表達以及端粒酶活性、端粒長度均未發生顯著變化，由此可見，SENP3可通過促進 Sp1的表達，進而增加端粒酶活性，延緩端粒長度的縮短。

綜上所述，本文在細胞水平上證明SENP3可通過誘導成骨細胞中Sp1的轉錄活性，進而增加端粒酶活性，延緩端粒長度的縮短，為預防老年性骨質疏松提供了新的治療靶點及理論依據，然而，SENP3抗骨質疏松的具體作用機制還有待進一步的研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of SENP3 on activity of telomerase and length of telomere of rat osteoblasts

SHI Su-qin1, PAN Yan1, YUE Xin1, ZHAO Lu2

(1TheFirstAffiliatedHospital,2PostdoctoralMobileStationofTraditionalChineseMedicine,PostdoctoralResearchandDevelopmentBaseoftheThirdAffiliatedHospital,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450008,China.E-mail:zhaolu.cn@163.com)

AIM: To analyze the effect of sentrin-specific protease 3 (SENP3) on the activity of telomerase and the length of telomere of rat osteoblasts. METHODS: The rat osteoblasts was treated with 0.2 mmol/L H2O2. The expression of SENP3 and specificity protein 1 (Sp1) was detected by Western blotting. The rat osteoblasts were transfected with pcDNA3.0-SENP3. The viability of the osteoblasts was evaluated by MTT assay. The concentrations of alkaline phosphatase (ALP) and osteopontin (OPN) were measured by ELISA. Osteocalcin (OCN) was measured by RIA. The expression of Sp1 and telomerase reverse transcriptase (TERT) were determined by Western blotting. The activity of telomerase was analyzed by PCR-TRAP method. The length of telomere was detected by PCR. pcDNA3.0-SENP3 and siRNA-Sp1 were co-transfected into osteoblasts, and the above indicators were measured. RESULTS: After the osteoblasts were treated with H2O2, the expression of SENP3 and Sp1 was significantly increased. After pcDNA3.0-SENP3 was transfected into the osteoblasts, the expression of Sp1 and TERT, the cell viability, and the concentrations of ALP, OCN and OPN were all dramatically increased. The activity of telomerase and the length of telomere were significantly enhanced. However, once pcDNA3.0-SENP3 and siRNA-Sp1 were co-transfected into the osteoblasts, no significantly change of above indicators was observed.CONCLUSION: SENP3 increases the expression of TERT through increasing the expression of Sp1, leading to the increase in the activity of telomerase and the length of telomere, finally enhances the viability of osteoblasts.

Sentrin-spectific protease 3; Specificity protein 1; Telomerase reverse transcriptase; Osteoblasts; Telomerase

1000- 4718(2016)11- 2043- 06

2016- 05- 07

2016- 08- 22

R681

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.021

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 15829303233； E-mail: zhaolu.cn@163.com