神經調節蛋白1對冠狀動脈平滑肌細胞表達血管生成因子的影響*

龐毅恒， 桂 春， 陳力銓

(廣西醫科大學第一附屬醫院西院心血管內科， 廣西 南寧 530021)

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神經調節蛋白1對冠狀動脈平滑肌細胞表達血管生成因子的影響*

龐毅恒， 桂 春△， 陳力銓

(廣西醫科大學第一附屬醫院西院心血管內科， 廣西 南寧 530021)

目的： 探討神經調節蛋白1(neuregulin-1，NRG-1)對人冠狀動脈平滑肌細胞(HCASMCs)表達血管生成因子的影響。方法:培養HCASMCs，實驗使用第3代細胞。用Western blot法檢測細胞ErbB的表達和磷酸化。在正常、缺氧缺血清或NRG-1(100 μg/L)處理條件下，用Western blot法檢測血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素1(Ang-1)和血管生成素2(Ang-2)表達的改變。結果:ErbB2、ErbB3和ErbB4均能在HCASMCs中表達，加入NRG-1后，這3種ErbB的磷酸化水平均增加。與對照組比較，在缺氧缺血清組HCASMCs中VEGF和Ang-1的表達明顯增加(P<0.05)，而Ang-2的表達差異無統計學顯著性。與缺氧缺血清組比較，NRG-1處理組的HCASMCs表達VEGF和Ang-1進一步顯著增加(P<0.05)，而Ang-2的表達差異無統計學顯著性。結論:HCASMCs能表達ErbB2、ErbB3和ErbB4，加入NRG-1增強ErbB2、ErbB3 和ErbB4 的磷酸化。缺氧缺血清和NRG-1處理均能增加VEGF和Ang-1在HCASMCs中的表達。

神經調節蛋白1; 人冠脈平滑肌細胞； 血管內皮生長因子; 血管生成素

神經調節蛋白(neuregulins，NRGs)是一個與表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)相關的生長和分化因子家族，目前研究較多的為NRG-1，其對胚胎心臟的發育和成年心臟功能的維護起著非常重要的作用[1]。NRG-1對血管生成的作用也有些研究報道。Hedhli等[2]研究發現在內皮細胞NRG-1敲除的小鼠中結扎股動脈，內皮NRG-1缺乏顯著減慢腿部血流的恢復、降低毛細血管密度和減少動脈發生,外源性給予NRG-1能加速血流的恢復，提示內皮產生的NRG-1是缺血誘導的血管生成和動脈發生所必需的。Xiao等[3]研究顯示，在心肌梗死中高表達NRG-1能增加缺血心肌的微血管數量。Nakaoka等[4]研究發現，NRG-1處理小鼠后，小鼠心臟中血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)表達明顯增加。我們前期研究顯示，給予NRG-1治療可顯著提高糖尿病大鼠心肌組織的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達、增加Flk和Tie-2受體磷酸化。我們研究還發現，在糖尿病和不穩定型心絞痛患者中，血清NRG-1濃度與VEGF和Ang-1濃度呈正相關[5]。以上研究提示NRG-1與其它血管生成因子可能存在某些相互作用和調控，在心肌血管生成中起著一定的作用。

所以本研究通過體外培養的人冠狀動脈平滑肌細胞(human coronary artery smooth muscle cells，HCASMCs)，檢測HCASMCs是否表達NRG-1及其受體，以及NRG-1處理后，HCASMCs VEGF、Ang-1和Ang-2表達的變化，為探索NRG-1在心肌血管生成中的作用提供基礎。

材 料 和 方 法

1 試劑與材料

HCASMCs原代細胞FC-0031、平滑肌細胞專用培養基、抗壞血酸、L-谷氨酰胺(L-glutamine)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Lifeline；抗NRG-1抗體為RD產品；抗VEGF、Ang-1和Ang-2抗體購自Santa Cruz；NRG-1、酪氨酸磷酸化抑制劑AG1478、兔抗ErbB2、ErbB3、ErbB4 多克隆抗體以及兔抗磷酸化的ErbB2、ErbB3、ErbB4 多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；內參照GAPDH抗體為中國中杉金橋公司產品。

2 HCASMCs的復蘇和培養

從液氮中取出原代人冠脈平滑肌細胞凍存管，37 ℃水浴完全溶解，經過清洗，轉移至25 cm2透氣培養瓶內于37 ℃、5% CO2培養箱進行培養。當細胞生長成單層達80%～90%的培養面積，用0.25%胰酶消化，然后傳代，實驗選用第3次傳代的HCASMCs進行。

3 不同干預與分組

取第3次傳代的HCASMCs進行培養，當長至鋪滿瓶底90%時，用2瓶按1∶3的比例傳代6瓶，待長至鋪滿瓶底90%左右，將細胞原有培養基吸棄，按分組要求加入含不同成分的培養基并置于不同要求條件下培養24 h后進行Western blot法檢測。實驗分為4組：空白對照組：培養基含血清不含NRG-1，該組細胞在37 ℃、5% CO2培養箱進行培養；缺氧缺血清組：培養基不含血清、不含NRG-1，在95%氮氣、5% CO2厭氧培養箱，37 ℃進行培養；NRG-1組：培養基不含血清，含100 μg/L NRG-1，在95%氮氣、5% CO2厭氧培養箱，37 ℃進行培養；NRG-1+抑制劑組：培養基不含血清，含NRG-1(100 μg/L)和抑制劑AG1478(10 μmol/L)，在95%氮氣、5% CO2厭氧培養箱，37 ℃進行培養。

4 Western blot檢測

將各組細胞收集到1.5 mL EP管，加入裂解液和PMSF提取細胞總蛋白，Bradford法檢測蛋白濃度，根據蛋白分子量，選取適宜濃度的分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后根據marker和目的條帶分子量大小進行切膠。因為ErbB2、ErbB3和ErbB4這3個蛋白表達于心肌組織，所以用大鼠心肌作為陽性對照。然后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，分步與適當濃度的 I 抗和辣根過氧化物酶標記的 II 抗結合。顯影后，計算機掃描膠片，用ImageJ成像系統對掃描膠片上對應的蛋白條帶的灰度進行分析，以目的條帶與內參照GAPDH 條帶的灰度比值來代表目標蛋白的相對表達量。

5 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間多重比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 NRG-1及ErbB在HCASMCs中的表達

HCASMCs經體外培養后，進行Western blot檢測，發現有NRG-1的受體ErbB2、ErbB3和ErbB4的表達，但HCASMCs不表達NRG-1。將受體的表達量與大鼠心肌組織比較，發現ErbB2和ErbB3表達豐度比心肌組織強，ErbB4表達豐度比心肌組織弱,見圖1。

2 NRG-1處理增加HCASMCs的ErbB磷酸化

經NRG-1干預后， HCASMCs的ErbB2、ErbB3和ErbB4磷酸化較空白對照組明顯增強(P<0.05)；

Figure 1. The expression of NRG-1 and ErbBs in the HCASMCs. A: the HCASMCs under microscope (×100); B: the expression of ErbB2, ErbB3 and ErbB4 in the HCASMCs and cardiac muscle (CM) detected by Western blot; C: the expression of NRG-1 and GAPDH in HCASMCs and CM detected by Western blot.

圖1 NRG-1及ErbBs在HCASMCs中的表達

然而在同時含有NRG-1和酪氨酸磷酸化抑制劑AG1478的HCASMCs中，ErbB2、ErbB3和ErbB4的磷酸化水平較僅經NRG-1處理的HCASMCs明顯降低,見圖2。

Figure 2. The phosphorylation levels of ErbB2, ErbB3 and ErbB4 in the HCASMCs with NRG-1 treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNRG-1 group.

圖2 NRG-1作用下HCASMCs ErbB2/3/4磷酸化水平

3 NRG-1處理對HCASMCs血管生成因子表達的影響

與對照組相比，缺氧缺血清條件下HCASMCs的VEGF和Ang-1表達水平明顯增加(P<0.05)；NRG-1干預下，VEGF和Ang-1的表達量與僅缺氧缺血清時相比較進一步增強(P<0.05)。但加入酪氨酸磷酸化抑制劑AG1478后，酪氨酸磷酸化受到抑制，VEGF和Ang-1的表達明顯減少。而Ang-2的表達量不受缺氧缺血清和NRG-1處理的影響,見圖3。

討 論

本研究首次發現HCASMCs能表達ErbB2、ErbB3和ErbB4，但不能表達NRG-1；NRG-1處理能增加ErbB2、ErbB3和ErbB4的磷酸化，提示NRG-1可能通過激活受體而產生生理作用；缺氧缺血清及NRG-1處理能增強VEGF和Ang-1的表達，但Ang-2因子的表達量未受影響。

Figure 3. The protein expression of VEGF, Ang-1 and Ang-2 in the HCASMCs with NRG-1 treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vshypoxia and serum deprivation group;△P<0.05vsNRG-1 group.

圖3 NRG-1影響HCASMCs表達VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白

不同的血管平滑肌細胞ErbBs的表達種類不盡相同。有研究報道，胸主動脈血管平滑肌細胞表達3個ErbB[6]，但還有研究結果相反，人主動脈平滑肌細胞僅表達ErbB1和ErbB2，不表達ErbB3和ErbB4[7]。近期研究人員表明大鼠主動脈平滑肌細胞能表達ErbB2/3/4的mRNA和ErbBs蛋白[8]。本研究結果表明，HCASMCs體外培養可表達NRG-1的3種特異受體——ErbB2、ErbB3和ErbB4。雖然我們的實驗結果表明HCASMCs其本身在體外培養時檢測不到NRG-1的表達，但這并不意味著HCASMCs不受NRG-1因子的調控，因為無論是在靠近心肌細胞的心肌微血管內皮細胞[9-10]，還是冠脈粥樣斑塊內的巨噬泡沫細胞都有高表達的NRG-1[11]。因此研究NRG-1對HCASMCs的影響具有現實意義。

前期研究發現，在多種組織和細胞發現存在一種缺氧誘導調控，適度的缺氧缺血清會使得缺氧誘導因子1表達升高，進而調控下游諸如VEGF、Ang-1、內皮素等多種血管生成因子的增加[12-13]。在本研究中，我們證實HCASMCs也會受缺氧缺血清誘導調控，上調血管生成因子VEGF和Ang-1的表達，但對Ang-2沒有顯著影響。在缺氧缺血清條件下，經NRG-1處理誘導，HCASMCs表達VEGF和Ang-1的水平還會進一步升高，提示NRG-1與缺氧缺血清協同對HCASMCs表達VEGF和Ang-1起正調控增強作用。NRG-1能促進HCASMCs VEGF和Ang-1的表達，推測與NRG-1/ErbB信號傳導有關。先前在心臟發育、成熟心臟[14-15]及癌細胞的血管生成[16]研究中發現，NRG-1可通過激活受體酪氨酸激酶的磷酸化進行系列的信號轉導發揮其生物學效應，使得VEGF因子表達增強。我們的研究發現，雖然HCASMCs不表達NRG-1，但受體ErbB2、ErbB3和ErbB4得到表達。在外源的NRG-1處理下，ErbB2、ErbB3和ErbB4磷酸化增強，說明NRG-1觸發了NRG-1/ErbB信號傳導，進而使得血管生成因子VEGF和Ang-1的表達量也隨之增加。這一結論可以由加入NRG-1的競爭性抑制劑AG1478獲得反證。當加入AG1478后，AG1478和ErbB結合，阻礙了NRG-1/ErbB傳導，從實驗檢測結果可以看到HCASMCs的ErbB2、ErbB3和ErbB4磷酸化受到抑制，血管生成因子VEGF和Ang-1的表達量也隨之回落。

[1] Odiete O, Hill MF, Sawyer DB. Neuregulin in cardiovascular development and disease[J]. Circ Res, 2012, 111(10):1376-1385.

[2] Hedhli N, Dobrucki LW, Kalinowski A, et al. Endothe-lial-derived neuregulin is an important mediator of ischaemia-induced angiogenesis and arteriogenesis[J]. Cardiovasc Res, 2012, 93(3):516-524.

[3] Xiao J, Li B, Zheng Z, et al.Therapeutic effects of neuregulin-1 gene transduction in rats with myocardial infarction[J]. Coron Artery Dis， 2012, 23(7):460-468.

[4] Nakaoka Y, Nishida K, Narimatsu M, et al. Gab family proteins are essential for postnatal maintenance of cardiac function via neuregulin-1/ErbB signaling[J]. J Clin Invest, 2007, 117(7):1771-1781.

[5] Zeng Z, Gui C, Nong Q, et al. Serum neuregulin-1β le-vels are positively correlated with VEGF and angiopoietin-1 levels in patients with diabetes and unstable angina pectoris[J]. Int J Cardiol, 2013, 168(3): 3077-3079.

[6] Shin HS, Lee HJ, Nishida M, et al. Betacellulin and amphiregulin induce upregulation of cyclin D1 and DNA synthesis activity through differential signaling pathways in vascular smooth muscle cells[J]. Circ Res, 2003, 93(4):302-310.

[7] Livanainen E, Nelimarkka L, Elenius V, et al. Angio-poietin-regulated recruitment of vascular smooth muscle cells by endothelial-derived heparin binding EGF-like growth factor[J]. FASEB J, 2003, 17(12):1609-1621.

[8] Kyotani Y, Ota H, Itaya-Hironaka A, et al. Intermittent hypoxia induces the proliferation of rat vascular smooth muscle cell with the increases in epidermal growth factor family and erbB2 receptor[J]. Exp Cell Res, 2013, 319 (19):3042-3050.

[9] Lemmens K, Segers VF, Demolder M, et al. Role of neuregulin-1/ErbB2 signaling in endothelium-cardiomyocyte cross-talk[J]. J Biol Chem, 2006, 281(28):19469-19477．

[10]Cote GM, Miller TA, LeBrasseur NK, et al. Neuregulin-1α and β isoform expression in cardiac microvascular endothelial cells and function in cardiac myocytesinvitro[J]. Exp Cell Res, 2005, 311(1):135-146.

[11]Xu G, Watanabe T, Iso Y, et al. Preventive effects of heregulin-β1on macrophage foam cell formation and athe-rosclerosis[J]. Circ Res, 2009, 105(5):500-510.

[12]Jian K, Jinge K, Bing P, et al. Insufficient radiofrequency ablation promotes angiogenesis of residual hepatocellular carcinoma via HIF-1α/VEGFA[J]. PLoS One, 2012, 7(5):e37266.

[13]Olave N, Nicola T, Zhang W, et al. Transforming growth factor-β regulates endothelin-1 signaling in the newborn mouse lung during hypoxia exposure[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2012, 302(9):L857-L865.

[14]Mendes-Ferreira P, De Keulenaer GW, Leite-Moreira AF, et al. Therapeutic potential of neuregulin-1 in cardiovascular disease[J]. Drug Discov Today, 2013, 18(17-18):836-842.

[15]Wadugu B, Kühn B. The role of neuregulin/ErbB2/ErbB4 signaling in the heart with special focus on effects on cardiomyocyte proliferation[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2012, 302(11):H2143-H2147．

[16]Yonezawa M, Wada K, Tatsuguchi A, et al. Heregulin-induced VEGF expression via the ErbB3 signaling pathway in colon cancer[J]. Digestion, 2008, 80(4):215-225.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Neuregulin-1 induces expression of angiogenic factors in coronary artery smooth muscle cells

PANG Yi-heng, GUI Chun, CHEN Li-quan

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:gui_chun@126.com)

AIM: To investigate the effects of neuregulin-1 (NRG-1) on the expression of angiogenic factors in human coronary artery smooth muscle cells (HCASMCs). METHODS: HCASMCs were culturedinvitro, and the cells at the 3rd passage were collected to assess the expression and phosphorylation of ErbB by Western blot. After HCASMCs were cultured under normal condition, with hypoxia and serum deprivation, or with NRG-1 treatment, the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), angiopoietin-1 (Ang-1) and angiopoietin-2 (Ang-2) was determined by Western blot. RESULTS: The expression of ErbB2, ErbB3 and ErbB4 was observed in the HCASMCs, and the phosphorylation of these receptors was increased by NRG-1 treatment. Compared with control group, the expression of VEGF and Ang-1 in the HCASMCs was significantly increased in hypoxia and serum deprivation group (P<0.05), while no difference in the expression of Ang-2 between the 2 groups was found. Compared with hypoxia and serum deprivation group, the expression of VEGF and Ang-1 in the HCASMCs treated with NRG-1 was further increased (P<0.05), and no difference in the expression of Ang-2 between the 2 groups was observed. CONCLUSION: HCASMCs express ErbB2, ErbB3 and ErbB4, and the phosphorylation of the receptors is increased by NRG-1. Hypoxia, serum deprivation and NRG-1 treatment induce the increased expression of VEGF and Ang-1 significantly.

Neuregulin-1; Human coronary artery smooth muscle cells; Vascular endothelial growth factor; Angiopoietin

1000- 4718(2016)11- 1945- 04

2016- 03- 24

2016- 09- 09

國家自然科學基金資助項目(No. 81160021；No. 81460063)；廣西自然科學基金重點課題 (No. 2014GXNSFDA118024)

R543.3； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.005

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