MPO、MMP-2和MMP-9在兔房顫模型心房肌中的表達變化*

楊 倩， 容春莉， 王立立， 宋學蓮， 齊曉勇

(河北省人民醫院心內科，河北 石家莊 050051)

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MPO、MMP-2和MMP-9在兔房顫模型心房肌中的表達變化*

楊 倩， 容春莉， 王立立， 宋學蓮， 齊曉勇△

(河北省人民醫院心內科，河北 石家莊 050051)

目的： 觀察兔房顫模型心房肌組織髓過氧化物酶(MPO)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表達，并探討三者與房顫時心房結構重構的關系。方法:20只新西蘭大白兔，開胸后于左心房植入起搏電極，隨機分為2組：快速心房起搏組(RAP組)以600 min-1的頻率快速起搏心房3周；假手術組(sham組)不予起搏。起搏前、后行超聲心動圖檢查評價心房和心室的結構和功能，行心房burst刺激檢測房顫誘發率；起搏后采用Masson染色評價心房的間質纖維化程度，采用RT-qPCR和Western blot檢測心房MPO、MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達水平。結果:起搏3周后，與sham組相比，RAP組兔左心房明顯擴張伴收縮功能障礙，左心室的結構和功能變化不明顯；RAP組房顫誘發率和間質纖維化百分比均明顯增加，且心房MPO、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表達明顯增加。結論:持續快速心房起搏兔房顫模型會出現明顯心房結構重構，心房MPO、MMP-2和MMP-9表達上調可能是其潛在的分子機制。

快速心房起搏； 心房顫動； 髓過氧化物酶； 基質金屬蛋白酶

心房顫動(atrial fibrillation，AF)，簡稱房顫，是臨床上最常見的心律失常之一[1]。它可以導致心血管疾病的致死率和致殘率增加，嚴重影響患者的壽命和生活質量，增加醫療支出和社會負擔[2]。近年來，雖然射頻消融和藥物治療取得了極大的進展，房顫的治療仍不盡如人意[3]。因此，深入探討房顫的發病機制，從而探索房顫治療的新方法，仍是臨床亟待解決的問題。

房顫發生和維持的主要機制是心房重構，其中心房結構重構不完全可逆，是房顫的中心環節，主要表現為心房擴張和間質纖維化[2,4]。近年來的研究表明，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，尤其是MMP-2和MMP-9的表達及活性增加與心房間質纖維化密切相關[5]；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)可以催化生成具有強氧化性的次氯酸，促進MMP-2和MMP-9的表達和活化，促進心房結構重構，最終導致房顫[6]。本研究通過快速心房起搏(rapid atrial pacing，RAP)的方法建立兔房顫模型，觀察該模型心房肌組織MPO、MMP-2和MMP-9表達的變化，并探討三者與房顫時心房結構重構的關系。

材 料 和 方 法

1 動物和材料

選用20只新西蘭大白兔作為實驗對象，體重2.5～3.5 kg，由河北醫科大學動物實驗中心提供。動物心臟起搏器購自上海復旦旦華科技有限公司，電壓5 V，起搏頻率為 600 min-1。采用Philip IU22超聲診斷儀測定各項心臟超聲指標；采用蘇州東方DF-5A型電生理刺激儀行心房burst刺激。MPO抗體購自Santa Cruz，MMP-2、MMP-9和內參照β-actin抗體均購自Protein Tech。

2 主要方法

2.1 兔房顫模型建立 3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經耳緣靜脈注射麻醉后，將兔仰臥位固定于動物手術臺上，備皮，于胸骨左緣第3、4肋間打開胸腔，暴露心臟，找到左心房，采用結扎左心耳的方法將起搏電極固定于左心房，引出電極，關閉胸腔。電極沿皮下隧道移行至右側后背部，應用電生理刺激儀測試電極，保證裸露導線與心房肌接觸良好，且與胸壁絕緣。于兔右側背部脊柱旁制作起搏器囊袋，用慶大霉素沖洗囊袋后，將動物起搏器與起搏電極連接固定，起搏器設置為關閉狀態，置于皮下囊袋中[7]。術后青霉素抗感染治療，恢復1周。

2.2 實驗分組 實驗兔隨機分為2組：快速心房起搏組(RAP 組)：開胸、固定左心房電極、持續起搏3周，每日行心電圖檢查，保證起搏器正常工作；假手術組(sham組)：開胸、固定左心房電極、不起搏。

2.3 超聲心動圖指標測定 采用超聲診斷儀于起搏前后行經胸無創心臟超聲檢查，測量左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左心室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心房內徑(left atrial diameter，LAD)。于心尖4腔切面及心尖兩腔切面，應用雙平面面積長度法，在二尖瓣開放前測量左心房最大容量(left atrial maximal volume，LAVmax)；在舒張末期(二尖瓣關閉后)測量左心房最小容量(left atrial minimal volume，LAVmin)。左心房射血分數(left atrial ejection fraction，LAEF)通過應用公式計算得出，公式為：LAEF=(LAVmax-LAVmin)/LAVmax×100%[8]。

2.4 房顫誘發率測定 采用電生理刺激儀于起搏前后行心房burst刺激測定房顫誘發率。給予S1S1刺激，周長50 ms，電壓為2倍舒張期閾值電壓+0.5 V，重復8次(前4次每次6 s，后4次每次12 s)[9]。計算公式：房顫誘發率(%)=誘發房顫成功兔只數/行Burst刺激兔總只數×100%。

2.5 心房間質纖維程度測定 采用4%多聚甲醛溶液固定左心房組織，石蠟包埋后制成厚度約為5 μm的石蠟切片，行Masson染色。顯微鏡下，心肌間質纖維呈藍色，心肌細胞呈紅色。每個標本選取5個視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件對獲得的圖片進行圖像分析，心房纖維化百分比(%)=心房纖維組織面積/(心房纖維組織面積+心房肌組織面積)×100%[9]。

2.6 心房MPO、MMP-2和MMP-9 mRNA的水平測定 取50 mg左心房心肌組織進行研磨，按照說明書，使用TRIzol(Invitrogen)試劑提取標本的總RNA。取2 μg總RNA參照逆轉錄試劑盒(Promega)說明逆轉錄成cDNA，反應條件為：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，90 ℃ 5 min。PCR引物由Gene Copoeia合成，具體引物序列見表1。將獲得的cDNA按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書方法擴增目的基因，PCR熱循環參數：96 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。以GAPDH為內參照。設對照組樣品為1，按2-ΔΔCt方法計算各目的基因的相對定量(relative quantification,RQ)值，將RQ值用于統計分析。

2.7 心房MPO、MMP-2和MMP-9蛋白的表達測定 取左心房心肌組織剪碎，用RIPA裂解液抽提心房肌組織總蛋白，Bardford比色法測定抽提蛋白的濃度。按照說明書進行操作，蛋白樣品與4×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液混合后電泳，然后經半干轉的方法轉移到PVDF膜，PVDF膜經5% BSA封閉2 h，用PBS稀釋的Ⅰ抗工作液4 ℃孵育過夜，再用1×PBST稀釋3 000倍的Ⅱ抗工作液處理90 min，蛋白條帶通過顯影、定影后，采用UVP分析儀器，對膠片進行掃描，系統自動生成每一個條帶灰度值。

表1 RT-qPCR的引物序列

3 統計學處理

運用SPSS 19.0軟件分析處理數據。計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組組內前后測量數據比較采用配對樣本t檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0．05 為差異有統計學意義。

結 果

1 動物存活情況

20只新西蘭大白兔，快速心房起搏組10只，術中死亡1只(死因為嚴重氣胸引起縱隔擺動)，起搏過程中通過每日復查心電圖，發現起搏器未能奪獲心房2只(原因為起搏閾值異常增高和起搏電極脫位)，實驗結束時成功7只。假手術組10只，術中死亡2只(死因為心房破損引起大出血和麻醉意外)，實驗過程中行心房burst刺激時，發現S1S1刺激(600次/分)未能奪獲心房1只(原因為起搏電極脫位)，實驗結束時成功7只。

2 超聲心動圖各指標的變化

起搏前,2組兔心房和心室的各項超聲指標的差異均無統計學顯著性。起搏3周后，關閉起搏器，再次對上述各項指標進行測量后發現：快速心房起搏組兔左心房較假手術組明顯擴張(圖1)，LAD、LAVmax和LAVmin明顯增加(P<0．05)，LAEF明顯下降(P<0．05)；快速心房起搏組兔左心室的LVEDD與假手術組比較差異無統計學顯著性，LVESD略增加(P<0.05)，LVEF略下降(P<0.05)，見表2。

Figure 1.Echocardiographic images of diastolic and systolic left atria. A: the left atria of sham group after 4 weeks post-operation; B: the left atria of RAP group after 3 weeks of RAP.

圖1 舒張期和收縮期的左心房超聲影像

表2 左心房和左心室結構和功能的變化

3 房顫誘發率的變化

起搏前行心電圖檢查，假手術組和快速心房起搏組兔均為竇性心律，經心房burst刺激均未能誘發房顫。起搏3周后，心電圖(圖2)顯示假手術組家兔仍為竇性心律，經心房burst刺激亦均未誘發房顫；快速心房起搏組家兔起搏器均良好起搏心房(心房刺激2∶1下傳心室，起搏頻率為600次/分，心室率為300次/分)，關閉心房起搏器后，心電圖證實其均維持竇性心律，經心房burst刺激后，7只兔子中有6只誘發持續性房顫(房顫持續時間大于30 min)，房顫誘發率為86%。

Figure 2.ECG recordings in limb leads (paper speed 50 mm/s). A: ECG showed that the rabbit was subjected to RAP at 600 beats/min; B: ECG showed that the rabbit was still in normal sinus rhythm after 3 weeks of RAP when the pacemaker was deactivated; C: ECG showed that after atrial burst pacing, AF was induced as showed disappearance of P-wave, and absolute irregularity of the RR interval.

圖2 肢體導聯心電圖

4 心房纖維化程度的變化

起搏3周后，快速心房起搏組心房纖維化百分比較假手術組明顯增加(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The left atrial myocardium with Masson trichrome-staining (×200). Mean±SD.n=7.#P<0.05vssham group.

圖3 左心房Masson染色

5 心房MPO、MMP-2和MMP-9 mRNA的表達

起搏3周后，快速心房起搏組心房MPO、MMP-2和MMP-9的mRNA水平較假手術組明顯增加(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.mRNA levels of MPO, MMP-2 and MMP-9 in the left atria. Mean±SD.n=7.#P<0.05vssham group.

圖4 左心房MPO、MMP-2和MMP-9 mRNA的水平

6 心房MPO、MMP-2和MMP-9蛋白的表達

起搏3周后，快速心房起搏組心房MPO、MMP-2和MMP-9的蛋白表達較假手術組明顯增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.Protein expression of MPO, MMP-2 and MMP-9 in the left atria. Mean±SD.n=7.#P<0.05vssham group.

圖5 左心房MPO、MMP-2和MMP-9蛋白的表達

討 論

快速心房起搏房顫動物模型重復性好、房顫誘發率高且持續時間長，是近年來應用最廣泛的房顫動物模型[10]。兔、犬、綿羊、豬等動物均可用于制備該房顫模型，其中應用較廣的是兔和犬房顫模型。犬的體積大、成本高，且持續快速心房起搏會導致心室率明顯加快，引起犬心衰[11]；如避免心衰，則需行房室結消融并植入心室起搏器控制心室率，這使得實驗操作的難度明顯增加[12]。兔的體積小、成本低，且有研究顯示持續快速心房起搏對兔的心功能無明顯影響[13]。本研究結果顯示：起搏3周后，快速心房起搏組7只兔中有6只可誘發持續性房顫，房顫誘發率高，且左心室的結構和功能較基線水平無明顯變化。

房顫發生和維持的主要機制是心房重構，包括電重構和結構重構。結構重構不完全可逆，相較于電重構，其在房顫中發揮更為重要的作用，主要表現為心房擴張和間質纖維化[2,4]。左房擴張是房顫的獨立危險因素，LAD增大的患者更容易發生陣發性房顫[14]，而LAV較大的房顫患者更易出現復律后房顫復發[15]。心房間質纖維化是結構重構的特征性改變，持續性房顫患者心房間質纖維化程度明顯高于孤立性房顫患者[16]。本研究結果顯示：起搏3周后，快速心房起搏組左房容量明顯擴張，擴張程度是起搏前的近4倍；心房間質纖維化明顯增加，約是假手術組的6倍。

MPO是由中性粒細胞和單核細胞等分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，其在房顫中發揮重要作用。它可以催化生成具有強氧化性的次氯酸，促進MMP-2和MMP-9的表達和活化[6]。研究顯示：皮下注射血管緊張素Ⅱ 2周后，野生鼠可見心房MPO、MMP-2和MMP-9表達明顯增加，心房纖維化和房顫誘發率明顯增加；MPO基因缺陷鼠心房MPO、MMP-2和MMP-9則呈低水平，心房纖維化不明顯，幾乎不能誘發房顫；MPO基因缺陷鼠給予重組MPO干預后，可出現與血管緊張素Ⅱ干預野生鼠相同程度的MMP-2和MMP-9表達、心房纖維化和房顫誘發率[6]。另外，房顫患者心房和血漿MPO水平明顯高于非房顫患者[6]，且射頻消融術后患者高水平的MPO常可預示術后房顫的復發[17]。本研究顯示，起搏3周后，快速心房起搏組兔心房MPO、MMP-2和MMP-9表達水平較假手術組均明顯增加，該模型心房結構重構可能與此有關。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Expression of MPO, MMP-2 and MMP-9 in atrial myocardium of rabbit atrial fibrillation model

YANG Qian, RONG Chun-li, WANG Li-li, SONG Xue-lian, QI Xiao-yong

(DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China.E-mail:hbghxiaoyong_q@126.com)

AIM: To investigate the expression of myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in the atrial myocardium, and their potential effects on atrial structural remodeling in a rabbit atrial fibrillation (AF) model. METHODS: The sternotomy was performed and the pacing electrode was fixed to the left atria of 20 New Zealand white rabbits. The animals were randomly divided into 2 groups: rapid atrial pacing (RAP) group and sham group. The rabbits in RAP group were subjected to RAP for 3 weeks. The structure and function of the atria and ventricle were analyzed by echocardiography. Atrial burst stimulation was performed to test AF inducibility. The atrial fibrosis was evaluated by Masson trichrome-staining. The mRNA and protein levels of MPO, MMP-2 and MMP-9 were detected by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: After 3 weeks of RAP, obvious left atrial enlargement and dysfunction were observed, but almost no change of left ventricular diameter and function was found in RAP group compared with sham group. AF inducibility, atrial interstitial fibrosis and the mRNA and protein levels of MPO, MMP-2 and MMP-9 were all significantly increased in RAP group compared with sham group. CONCLUSION: Obvious atrial structural remodeling is found in the rabbit AF model induced by sustained RAP, and the up-regulation of MPO, MMP-2 and MMP-9 may be the potential molecular mechanism of atrial structural remodeling.

Rapid atrial pacing; Atrial fibrillation; Myeloperoxidase; Matrix metalloproteinase

1000- 4718(2016)11- 1934- 05

2016- 06- 17

2016- 08- 22

河北省醫學科學研究重點課題計劃(No. 20160475)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.003

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