Urocortin-I預處理對離體大鼠心肌線粒體呼吸功能及呼吸酶活性的影響*

劉 雪， 顧 燕， 田 偉， 張 琳， 李 佳， 鄧勝利△

(1遵義醫學院麻醉學系，貴州省麻醉與器官重點保護實驗室，貴州 遵義 563000；2重慶市婦幼保健院麻醉科，重慶 400013；3遵義市播州區人民醫院麻醉科，貴州 遵義 550001；4遵義醫學院附屬醫院麻醉科，貴州 遵義 563000)

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Urocortin-I預處理對離體大鼠心肌線粒體呼吸功能及呼吸酶活性的影響*

劉 雪1， 顧 燕2， 田 偉3， 張 琳1， 李 佳4， 鄧勝利4△

(1遵義醫學院麻醉學系，貴州省麻醉與器官重點保護實驗室，貴州 遵義 563000；2重慶市婦幼保健院麻醉科，重慶 400013；3遵義市播州區人民醫院麻醉科，貴州 遵義 550001；4遵義醫學院附屬醫院麻醉科，貴州 遵義 563000)

目的： 探討urocortin-I預處理對離體大鼠缺血再灌注心肌線粒體呼吸功能及酶活性的影響，觀察心肌細胞ATP含量的變化。方法:(1) 健康雄性SD大鼠隨機分為4組：正常組(Nor組)、缺血再灌注組(IR組)、urocortin-I預處理組(Ucn I組)、5-羥葵酸(5-HD)拮抗urocortin-I組(5-HD+Ucn I組)。采用Langendorff裝置建立大鼠離體心臟缺血再灌注模型。分別于平衡末(T1)、缺血前(T2)及再灌注末(T3)分離、提取心肌線粒體，測定各組線粒體呼吸功能及呼吸酶活性。(2) 利用MPA離體心臟灌注裝置分離成年大鼠心肌細胞，將分離培養24 h后同批次的心肌細胞隨機分為正常組(Nor組)、缺氧復氧組(I/R組)、urocortin-I預處理組(Ucn I組)、5-HD拮抗urocortin-I組(5-HD+Ucn I組)。建立缺氧復氧模型，于復氧末用高效液相色譜法檢測各組心肌細胞ATP含量。結果:T3時點除Nor組外，其余各組與T1、T2時點相比呼吸功能(3態呼吸速率、呼吸控制率)及琥珀酸氧化酶、NADH氧化酶、細胞色素C氧化酶活性均明顯下降(P<0.05)；T3時 Ucn I組心肌線粒體的呼吸功能及呼吸酶活性明顯優于5-HD+Ucn I組及IR組(P<0.05)，但次于Nor組(P<0.05)；T3時5-HD+Ucn I組心肌線粒體的呼吸功能及呼吸酶活性(琥珀酸氧化酶、NADH氧化酶)較IR組好 (P<0.05)，但2組間細胞色素C氧化酶活性差異無統計學顯著性；T1、T2時點各組組內及組間呼吸功能及3種呼吸酶活性的差異無統計學顯著性。心肌細胞實驗結果顯示，復氧末Nor組 ATP含量較其余各組均高(P<0.01)；I/R組和5-HD+Ucn I組心肌細胞的ATP含量較Ucn I組低(P<0.05)；此外，5-HD+Ucn I組心肌細胞的ATP含量較I/R組高(P<0.05)。結論:Ucn I預處理可減輕缺血再灌注對心肌線粒體呼吸功能及呼吸酶活性的干預,保證了缺氧/復氧后心肌ATP的含量。

Urocortin-I； 心肌線粒體呼吸功能； 再灌注損傷； ATP

線粒體作為細胞的“動力工廠”，約80%～90%的ATP是由位于線粒體內膜上的呼吸鏈及ATP合酶加工而成的，故線粒體呼吸功能與酶活性的正常與否及線粒體結構是否完整直接影響著心肌ATP能量的生成與代謝[1]。目前認為，心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的病理生理基礎是細胞能量代謝障礙，ATP合成減少。研究已經表明[2]，urocortin-I(Ucn I)可增加冠脈血流、同時可保護缺血再灌注后心臟的收縮功能，但此心功能的保護勢必需要心肌能提供足量的ATP，即心肌線粒體呼吸功能及呼吸酶活性的正常發揮作為支撐。目前關于urocortin-I預處理對缺血再灌注心肌線粒體的呼吸功能及酶活性的影響尚不清楚。因此本研究采用urocortin-I預處理缺血再灌注大鼠心肌觀察線粒體呼吸功能、呼吸酶活性及心肌細胞內ATP含量的變化，進一步探討其保護機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、心肌細胞及分組

清潔級健康雄性SD大鼠72只，體重250～300 g，16～20周。由第三軍醫大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2012-0005。采用隨機數字表法，將大鼠隨機分為4組：正常(normal，Nor)組、缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR)組、urocortin-I預處理組(Ucn I組)和5-羥葵酸(5-hydroxy acid，5-HD)拮抗urocortin-I組(5-HD+Ucn I組)。利用MPA離體心臟灌注裝置分離成年大鼠心肌細胞，將分離培養24 h后存活率在80%以上的同批次心肌細胞同樣隨機分為4組：正常組(Nor組)、缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,I/R)組、urocortin-I預處理組(Ucn I 組)、5-羥葵酸拮抗urocortin-I組(5-HD+Ucn I組)。

2 主要試劑及儀器

Urocortin-I、5-羥葵酸(Sigma)；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天生物研究所)；其它試劑為國產分析純。Langendorff大鼠離體心臟灌注裝置(PanLab)；5804R型Eppendorf臺式高速離心機(Eppendorf)；氧電極(Hansatech Ltd)。

3 主要液體的配制

(1) Kerbs-Henseleit(K-H)緩沖液(mmol/L)：NaCl 118、KCl 4.75、CaCl22.5、NaHCO324.8、MgCl2·6H2O 1.19、KH2PO41.19、glucose 11.1；(2) ST. Thomas停跳液(mmol/L)：NaCl 110、KCl 16、CaCl21.2、NaHCO310、MgCl216，pH 7.8，4 ℃保存；(3) 線粒體分離介質(mmol/L)：海藻糖300、Hepes 10、KCl 10、EGTA 1、EDTA 1，pH 7.4，4 ℃保存；(4) 線粒體呼吸測定介質(mmol/L)：蔗糖250、MOPS 10、KH2PO45；(5) 細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)氧化酶測定介質：磷酸鉀緩沖液10 mmol/L、TMPD 27 mmol/L、Cyt C 13 μmol/L；(6) NADH氧化酶測定介質(mmol/L)：磷酸鉀緩沖液80、NADH 3、Cyt C 0.013；(7) 琥珀酸氧化酶測定介質(mmol/L)：磷酸鉀緩沖液80、琥珀酸5、Cyt C 0.013；(8) 灌注母液(mmol/L)：NaHPO40.4、NaCl 130、Hepes 5、glucose 10、KCl 5.4、MgCl2·6H2O 3.5；超純水用95% O2、5% CO2混合氣體飽和15 min配置，調pH至7.30；(9) 心肌細胞酶消化液：灌注母液中加入CaCl2和Ⅱ型膠原酶，使Ca2+和Ⅱ型膠原酶終濃度分別為90 μmol/L和0.1%；(10) M199培養基：M199中加入肌酸5 mmol/L、牛磺酸5 mmol/L、肉毒堿 2 mmol/L、谷氨酸2 mmol/L、乙二醇雙四乙酸0.8 mmol/L。過濾除菌后4 ℃下保存，使用前加入終濃度為100 U的雙抗(青霉素和鏈霉素)。

4 方法

4.1 離體大鼠心肌Langendorff灌注模型的建立 參照文獻[3]建立離體心臟灌注模型，經腹腔注射肝素(250 U/kg)、戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，麻醉后迅速取出心臟，置于4 ℃的K-H液中，液面下主動脈插管，連接于Langendorff離體心臟灌注裝置上。用37 ℃預先氧氣平衡的K-H液行心臟逆灌注，維持灌注壓70 mmHg，將自制乳膠水囊經二尖瓣插入左心室，連接Powerlab生物機能實驗壓力換能系統，調整水囊大小及位置使最初左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)在4～8 mmHg范圍內。離體心臟Langendorff灌注模型制備成功標準為平衡20 min后心率(heart rate，HR)>250次/分、左室發展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)>80 mmHg、室性早搏 <2個/分，未達標準者舍棄。

4.2 灌注方法與處理 各組灌注平衡20 min后，Nor組續灌K-H液135 min；I/R組續灌55 min，缺血前灌注4 ℃的ST. Thomas停跳液，32 ℃下全心缺血40 min，復灌60 min；Ucn I組缺血前給予含Ucn I(10-8mol/L)的K-H液灌注30 min后，余處理同IR組；5-HD+Ucn I組用Ucn I預處理前先給予含5-HD(10-4mol/L)的K-H液灌注5 min，其余處理同Ucn I組。

4.3 心肌線粒體呼吸功能及呼吸酶活性變化的測定 分別于平衡末(T1)、缺血前(T2)、再灌注末(T3)時點參照文獻[4]中的方法提取心肌線粒體，根據Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明，采用全波長酶標儀進行線粒體蛋白質定量。參照文獻[5]中的方法使用漢莎氧電極測定線粒體呼吸功能：反應液總體積1 000 μL，先加入線粒體呼吸測定介質900 μL，反應溫度37 ℃，平衡30 min后啟動電磁攪拌器；加入蛋白濃度為1 g/L的線粒體懸液50 μL，記錄氧耗在40～60 s左右的曲線；待氧耗曲線平穩后，加入魚藤酮(終濃度2 μmol/L,為了防止電子從復合物Ⅱ倒流至復合物Ⅰ，故以琥珀酸為底物時，需加入呼吸鏈抑制劑魚藤酮)1 μL及琥珀酸(5 mol/L)10 μL，進入4態呼吸(State4)，記錄1 min；待氧耗曲線斜率穩定后，向反應液中加入ADP(100 μmol/L)9 μL，進入3態呼吸(State3)，記錄耗氧曲線變化情況；當ADP全部磷酸化轉變為ATP后，線粒體再次進入4態呼吸；線粒體呼吸控制率(respiratory control rate，RCR)= State3/State4。參照文獻[6]使用漢莎氧電極測定線粒體呼吸酶活性：在-80 ℃與-20 ℃冰箱中將線粒體反復凍融3次，制備線粒體亞單位，反應液總體積為1 000 μL，分別加入NADH氧化酶測定介質、細胞色素C氧化酶測定介質、琥珀酸氧化酶測定介質900 μL，控制反應溫度為37 ℃；平衡15～20 min，再加入蛋白濃度為1 g/L的線粒體懸液50 μL，記錄15 min氧耗曲線。

4.4 成年SD大鼠心肌細胞的分離與培養 參照文獻[7]方法分離成年SD大鼠心肌細胞，用75%乙醇沖洗MPA離體心臟灌注裝置，浸泡10 min，再用大量無菌超純水灌洗。將層黏連蛋白鋪板，放入37 ℃ CO2培養箱。麻醉與手術方法同上，立即將剪下的心臟放入提前加熱至37 ℃ 的Ca2+液(750 μmol/L)中輕輕擠壓心臟2～3次，使心腔的血液排盡。迅速用鑷子于液面下夾起大鼠心臟主動脈根部固定于MPA離體心臟灌注裝置上(流量設置9 mL/g心臟組織)；依次灌注經氧和的37 ℃的Ca2+液(750 μmol/L)2 min、EGTA(100 μmol/L) 4 min、心肌細胞酶消化液12～15 min。剪下酶灌注消化后的心臟，從主動脈向心尖剪開心肌，放入無菌燒瓶中，加入含有1%牛血清白蛋白的心肌細胞酶消化液5 mL，于37 ℃恒溫水浴搖床在氧合情況下振蕩，每次5 min，200目尼龍濾網過濾收集在無菌離心管里，置于37 ℃恒溫水浴箱內自然下沉，重復4～5次，收集細胞沉淀，酶洗脫沉淀3～4次，M199培養基洗滌3次。吸除層黏連蛋白，加入M199培養基，將細胞計數以104/cm2的密度均勻鋪于6孔板。倒置相差顯微鏡下觀察心肌細胞形態，評價存活率(80%以上)，放入細胞培養箱。

4.5 心肌細胞的處理方法 將培養24 h后存活率在80%以上的心肌細胞按實驗分組進行不同處理。 Nor組：37 ℃常氧(95% O2、5% CO2)培養箱中持續培養155 min；I/R組：常氧持續培養55 min，缺氧(95%N2、5%CO2)40 min，復氧60 min；Ucn I 組：缺氧前給予含Ucn I(10-8mol/L)的培養基30 min后，余處理同I/R組；5-HD+Ucn I組：Ucn I預處理前先給予含5-HD(10-4mol/L)的培養基5 min，其余處理同Ucn I組。

4.6 心肌細胞ATP含量的測定 參照文獻[8]方法測定心肌細胞ATP含量，收集復氧末各組心肌細胞，置于15 mL離心管中，1 000×g離心5 min，棄上清，加入預冷至4 ℃的0.4 mol/L高氯酸10 mL，超聲勻漿充分裂解細胞，10 000×g離心10 min，取上清用1 mol/L K2HPO4將pH調至6.0～7.0，再次10 000×g離心10 min，取上清做色譜分析。以上所有操作均在4 ℃冰面上完成。色譜柱為不銹鋼反向柱(Kromasil C18，5 μm，150 mm×4.6 mm )；柱溫25 ℃；流動相為經0.22 μm濾膜過濾、超聲脫氣后的磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；淋洗條件為流速1 mL/min；檢測波長為254 nm；進樣量 10 μL；參照ATP標準品的保留時間，確定檢測樣品中ATP的色譜峰，峰面積的大小代表ATP含量。

5 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組線粒體呼吸功能的變化

T3時間點除Nor組外，其余各組與T1、T2時點相比3態呼吸速率、RCR均明顯下降(P<0.05)；組間T3時點Ucn I組3態呼吸速率、RCR明顯高于IR組與5-HD+Ucn I(P<0.05)，但低于Nor組(P<0.05)；而IR組3態呼吸速率、RCR仍低于5-HD+Ucn I(P<0.05)；T1、T2時點各組組內及組間3態呼呼吸速率、RCR的差異無統計學顯著性，見表1、2。

表1 各組3態呼吸速率在不同時點的變化

表2 各組呼吸控制率在不同時點的變化和缺氧/復氧后各組心肌細胞ATP含量的變化

Table 2.The changes of mitochondrial respiratory control rate in each group at different time points and the changes of ATP contents after anoxia/reoxygenation (Mean±SD.n=6)

*P<0.05 vs T3; #P<0.05 vs Nor; △P<0.05 vs I/R; ▲P<0.05 vs Ucn I.

2 各組線粒體呼吸酶活性的變化

T3時點除Nor組外，其余各組與T1、T2時點相比3種酶(琥珀酸氧化酶、NADH氧化酶、細胞色素C氧化酶)的活性均明顯下降(P<0.05)；組間T3時點Ucn I組3種酶活性明顯高于I/R組與5-HD+Ucn I組(P<0.05)，但低于Nor組(P<0.05)；而I/R組的琥珀酸氧化酶、NADH氧化酶活性明顯低于5-HD+Ucn I組(P<0.05)，但細胞色素C氧化酶活性2組間差異無統計學顯著性；T1、T2時點各組組內及組間3種酶的活性間的差異無統計學顯著性，見表3～5。

表3 各組琥珀酸氧化酶活性在不同時點的變化

表4 各組NADH氧化酶活性在不同時點的變化

表5 各組細胞色素C氧化酶活性在不同時點的變化

3 各組心肌細胞ATP含量的變化

用ATP標準品制作的標準曲線各劑量線性關系極好(R2=1)。復氧末各組心肌細胞ATP含量比較可見，Nor組心肌細胞的ATP含量較其余各組均高(P<0.01)；而I/R組和5-HD+Ucn I組心肌細胞的ATP含量低于Ucn I組(P<0.05)；但5-HD+Ucn I組心肌細胞的ATP含量高于I/R組(P<0.05)，見圖1、表2。

Figure 1.The chromatographic peaks of ATP standard (A) and the ATP contents in the tested samples (B).

圖1 ATP標準品的色譜峰和待測樣品ATP含量的色譜峰

討 論

Ucn I是促腎上腺皮質激素家族中的新成員，可改善缺血再灌注后鼠的心臟功能，10-8mol/L是目前研究其心肌保護作用的常用濃度[9]。5-HD作為選擇性mito-KATP通道的阻滯劑，10-4～10-6mol/L的濃度可阻斷其通道的開放[10]。 因此，本研究參照文獻[9-10]確定Ucn I和5-HD的給藥濃度與時間。

線粒體是細胞的能量工廠，其呼吸狀態有4種，且3態呼吸及4態呼吸最為重要，3態呼吸主要反映ADP對線粒體氧化呼吸刺激的效應，4態呼吸反映無ADP時呼吸鏈的氧化功能，也意味此時無ATP的合成。RCR是3態呼吸與4態呼吸之比，常作為評價線粒體呼吸功能活力的指標，也是客觀評價線粒體氧化磷酸化功能與結構完整性的重要指標。眾所周知，線粒體有2條重要的呼吸鏈，即NADH氧化呼吸鏈和琥珀酸氧化呼吸鏈，而鏈上的NADH氧化酶和琥珀酸氧化酶分別位于復合體Ⅰ和復合體Ⅱ，代表了復合體Ⅰ和復合體Ⅱ的活性，而細胞色素C氧化酶是2條呼吸鏈上的關鍵酶，上述酶活性與功能的受損會使整個呼吸鏈的工作效率降低，ATP產生減少。

本實驗結果表明，再灌注末Nor組的琥珀酸氧化酶、NADH氧化酶、細胞色素C氧化酶3種酶活性及呼吸功能(3態呼吸速率，RCR)均優于其余各組，提示缺血再灌注可破壞線粒體呼吸功能及酶的活性，這與萬福生等[11]研究結果相一致。然而我們的結果還顯示再灌注末Ucn I 組各項指標均好于I/R組，說明Ucn I 預處理能夠保護缺血再灌注條件下心肌線粒體的呼吸功能及酶的活性。但當我們在Ucn I 預處理之前使用特異性mito-KATP通道阻滯劑5-HD，發現5-HD能拮抗Ucn I 對線粒體呼吸功能及酶活性的保護作用，說明Ucn I 預處理對呼吸功能及酶活性的保護作用與其能開放mito-KATP通道有關。既往研究已經證實，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的爆發可攻擊線粒體膜上易氧化的心磷脂，心磷脂受損會影響線粒體膜結構的完整性，使細胞色素C釋放進入胞漿，觸發細胞凋亡，影響線粒體呼吸功能及呼吸酶的活性。而近年研究發現，Ucn I 實際為ATP敏感性鉀通道的開放劑，其通道開放可抑制ROS爆發，維持缺血再灌注后心磷脂含量[12]，維護線粒體膜的完整性，改善了線粒體呼吸功能及呼吸酶的活性，保證線粒體電子傳遞的正常進行及ATP合成；另一方面，線粒體鉀通道開放可通過降低或者逆轉線粒體內Ca2+超載，在一定程度上保護了線粒體的呼吸功能[13-14]，而5-HD+Ucn I 組的RCR、3態呼吸速率、琥珀酸氧化酶、NADH氧化酶指標仍好于I/R組，說明5-HD不能完全阻斷Ucn I 預處理對線粒體呼吸功能及酶活性的保護作用，提示除了mito-KATP通道外還可能有其它因素共同參與。是否與Ucn I 同時也能開放胞膜KATP(sarcKATP)[15-16]通道或鈣激活鉀通道[17]有關，這需要我們進一步研究予以證實。眾所周知，線粒體呼吸功能及呼吸酶活性的正常與否直接關系著ATP的產生與供給，而本實驗復氧末各組心肌細胞ATP含量顯示，Ucn I 組心肌細胞ATP含量明顯高于I/R組與5-HD+Ucn I 組,但低于Nor組，進一步說明了Ucn I 預處理對缺血再灌注離體大鼠心肌線粒體呼吸功能及酶活性的保護作用。關于在本實驗中5-HD+Ucn I 組細胞色素C氧化酶與IR組相比，其差異沒有統計學顯著性，可能是5-HD能完全阻斷Ucn I 預處理對細胞色素C的保護作用，此結果讓人困惑，其具體原因尚需進一步研究。

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(責任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Effects of urocortin-I preconditioning on myocardial mitochondrial respiratory function and enzyme activity in rats

LIU Xue1, GU Yan2, TIAN Wei3, ZHANG Lin1, LI Jia4, DENG Sheng-li4

(1DepartmentofAnesthesiology,ZunyiMedicalUniversity,AnesthesiaandOrganProtectionLaboratoryinGuizhou,Zunyi563000,China;2DepartmentofAnesthesiology,MaternityandChildCareHospitalinChongqing,Chongqing400013,China;3DepartmentofAnesthesiology,ZunyiPeople’sHospitalofBozhouDstrict,Zunyi550001,China;4DepartmentofAnesthesiology,TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversity,Zunyi563000,China.E-mail:zydsl2004@163.com)

AIM: To investigate the influence of urocortin-I (Ucn I) preconditioning on the myocardial mitochondrial respiratory function and enzyme activity in the rats with ischemia reperfusion, and to observe the changes of ATP content in the myocardial cells. METHODS: (1) The healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups: normal group (Nor group), ischemia reperfusion group (IR group), Ucn I preconditioning group (Ucn I group), 5-hydroxy acid (5-HD)+Ucn I group. Langendorff perfusion was used to establish theinvitromodel of cardiac ischemia reperfusion. At the end of the balance (T1), before ischemia (T2) and at the end of the reperfusion (T3) respectively, the myocardial mitochondria was extracted, the mitochondrial respiratory function and respiratory enzyme activity in each group were determined. (2) The method of MPA isolated heart perfusion was used to isolate myocardial cells of the adult rats. After cultured for 24 h, myocardial cells were divided into 4 groups: Nor group, hypoxia/reoxygenation group (I/R group), Ucn I group, 5-HD+Ucn I group. Hypoxia/reoxygenation model of myocardial cells was established. At the end of reoxygenation, the changes of myocardial ATP content were measured by high performance liquid chromatography.RESULTS: (1) Compared with T1, T2time points, the respiratory function (state 3 respiratory rate, respiratory control rate) and NADH oxidase, succinate oxidase and cytochrome C oxidase activities at T3time point were significantly decreased (P<0.05) in all groups except Nor group. At T3time point, the myocardial mitochondrial respiratory function and respiratory enzyme activity in Ucn I group were superior to 5-HD+Ucn I group and IR group (P< 0.05), but was inferior to Nor group (P<0.05). At T3time point, the respiratory function of myocardial mitochondria and respiratory enzyme activities (NADH oxidase, succinate oxidase) in 5-HD+Ucn I group were better than those in IR group (P<0.05), but no statistical difference of the cytochrome C oxidase activity between the 2 groups was observed. The respiratory function and 3 kinds of respiratory enzyme activities at T1, T2time points had no statistical change. (2) At the end of the reoxygenation, the myocardial ATP content in Nor group was higher than that in other groups (P<0.01). The myocardial ATP contents in I/R group and 5-HD+Ucn I group were lower than that in Ucn I group (P<0.05). In additon, 5-HD+Ucn I group was higher ATP content compared with I/R group (P<0.05). CONCLUSION: Ucn I preconditioning attenuates the ischemia/reperfusion induced damages of myocardial mitochondrial respiratory function and respiratory enzyme activity, thus ensuring the myocardial ATP contents under the condition of hypoxia/reoxygenation.

Urocortin-I; Myocardial mitochondrial respiratory function; Reperfusion injury; ATP

1000- 4718(2016)11- 1928- 06

2016- 08- 22

2016- 10- 13

貴州省科技廳社會發展公關項目 (黔科合J字[2008]2196號)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.002

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