豬脾轉(zhuǎn)移因子的制備和生物學(xué)活性研究

杜聯(lián)峰，夏嬙，余妍，楊瑞，郭錦錦，孫萬邦，朱進(jìn)軍

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)·貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，廣東 珠海 519041)

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豬脾轉(zhuǎn)移因子的制備和生物學(xué)活性研究

杜聯(lián)峰，夏嬙，余妍，楊瑞，郭錦錦，孫萬邦，朱進(jìn)軍

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)·貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，廣東 珠海 519041)

目的：采用凍融-透析法制備豬脾轉(zhuǎn)移因子，并對其理化性質(zhì)以及免疫學(xué)生物學(xué)活性、生物安全性進(jìn)行初步檢定。方法：采用低溫勻漿反復(fù)凍融新鮮的豬脾臟、無菌離心勻漿脾臟組織液，取上清液透析制備轉(zhuǎn)移因子；以改良Lowry法分別檢測多肽含量，并進(jìn)行理化指標(biāo)、無菌試驗、熱原質(zhì)試驗及其生物學(xué)活性檢測。結(jié)果：凍融-透析法制備豬脾轉(zhuǎn)移因子的理化性狀符合《中國生物制品》的要求；無菌試驗、熱原質(zhì)試驗均為陰性；安全試驗合格；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗和E花環(huán)形成試驗證實其具有刺激淋巴細(xì)胞增殖生物學(xué)活性。結(jié)論：成功制備了豬脾臟轉(zhuǎn)移因子，其各項理化指標(biāo)符合生物制品規(guī)程的要求，同時具有較好的非特異性免疫學(xué)的生物學(xué)活性。

轉(zhuǎn)移因子；非特異性免疫學(xué)生物學(xué)活性；理化性質(zhì)

轉(zhuǎn)移因子(transfer factor，TF)是從具有免疫活性的淋巴細(xì)胞中所釋放出的一種具有生物學(xué)活性的物質(zhì)，免疫活性淋巴細(xì)胞在抗原刺激下釋放的TF能使未致敏的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有免疫活性的淋巴細(xì)胞，又能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能，以利于殺滅細(xì)胞內(nèi)感染的病原微生物(各種病毒、細(xì)菌、霉菌及寄生蟲等)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。TF主要成分是活性多肽，具有分子量小、無種屬特異性、無免疫原性、不易引起超敏反應(yīng)等諸多優(yōu)點[1]。并且在臨床治療先天或后天免疫缺陷病、各種病毒感染性疾病等方面的取得了較好的療效，因此TF在臨床上應(yīng)用有一定的應(yīng)用前景[2-3]。近年來，隨著各種新發(fā)傳染病如：SARS、H7N9等病毒性傳染病以及過敏性疾病在臨床上出現(xiàn)越來越多，轉(zhuǎn)移因子作為一種免疫調(diào)節(jié)劑受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]。本研究采用凍融-透析法制備TF，并研究其理化性質(zhì)和體外的非特異免疫學(xué)生物學(xué)功能，為豬脾轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)和應(yīng)用上提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與器材

昆明小鼠，20 g左右，10只，遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)實驗動物中心提供；健康家兔，3～4 kg左右，6只，遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)實驗動物中心提供；新鮮豬脾臟，細(xì)胞計數(shù)板，顯微鏡，ELx-800型酶標(biāo)儀。

1.2 實驗試劑

EZ-SepTMMouse小鼠脾淋巴細(xì)胞分離液購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，Cell Counting Kit-8( CCK-8)試劑購自日本同仁化學(xué)公司，RPMIl64O 培養(yǎng)液購自Gibico公司，胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)購自Hyclone公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 透析法制備豬脾轉(zhuǎn)移因子 將新鮮豬脾放于潔凈方盤中，去除其筋膜、脂肪，然后用無菌三蒸水沖洗3次，剪成細(xì)小的碎塊，稱量后放入電動高速組織搗碎機(jī)中，按1:1比例加入無菌三蒸水，高速勻漿2 min。勻漿后的漿體用潔凈的方盤盛裝，放入-20 ℃低溫冰箱中冷凍，在于37 ℃水浴中融化，反復(fù)凍融3次 ，3 000 r/min離心10 min，將上清液裝入透析袋，放入按1∶1比例加入無菌三蒸水，于4 ℃透析，每12 h換液，換液兩次，收集透析液，過濾除菌，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 理化性狀的檢定 采用肉眼觀察豬脾轉(zhuǎn)移因子的顏色及其表觀性狀；測量pH值；紫外分光光度計進(jìn)行多波長掃描，計算260 nm/280 nm OD值比值；改良Lowry法檢測多肽的含量。并參照《中國生物制品規(guī)程》[9]進(jìn)行無菌試驗、熱原質(zhì)試驗和安全試驗。

1.3.3 豬脾轉(zhuǎn)移因子生物學(xué)活性檢測 (1)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗：采用密度梯度離心法分離提取小鼠脾淋巴細(xì)胞，斷頸處死小鼠，浸泡于75%的酒精中，在超凈臺內(nèi)無菌取出小鼠脾臟，在培養(yǎng)皿中放入8 mL EZ-SepTMMouse 1×淋巴細(xì)胞分離液，用玻璃注射器芯將脾臟在400目金屬網(wǎng)上輕輕地研磨，取細(xì)胞懸液立即轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，輕輕加入500 μL的RPMI 1640培養(yǎng)基液覆蓋(保持液面分界明顯)。室溫，800 g離心30 min，離心結(jié)束后細(xì)胞分層。吸取淋巴細(xì)胞層加入到另1只15 mL離心管中，再加入10 mL 1640培養(yǎng)基，顛倒洗滌。室溫，250 g離心10 min收集細(xì)胞，傾倒上清液，再用無菌Hank’s液輕輕吹打混勻洗滌細(xì)胞兩遍后，用含10%FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù)，活細(xì)胞數(shù)大于97%以上，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×105個/mL，細(xì)胞懸液鋪96孔板，每孔100 μL。細(xì)胞置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗設(shè)實驗組、陰性對照組及陽性對照組，每組設(shè)4個復(fù)孔，實驗組加入豬脾轉(zhuǎn)移因子使其終濃度為：實驗分為實驗組(分為4個濃度梯度)、PHA陽性對照組、陰性對照組。每組設(shè)4個復(fù)孔，實驗組根據(jù)測量的轉(zhuǎn)移因子原液多肽含量進(jìn)行稀釋，每孔加入5 μL，終濃度為1 mg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL，陽性對照組加入PHA使其終濃度為5 μg/mL。細(xì)胞置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育3 h后，酶標(biāo)儀450 nm測量A值。(2)E玫瑰花環(huán)形成試驗檢測轉(zhuǎn)移因子生物活性：無菌抽取3 mL EDTA抗凝人靜脈血，加入等量Hank’s液混勻后，用毛細(xì)吸管將其轉(zhuǎn)移至3 mL人淋巴細(xì)胞分離液上，1 500 r/min，離心15 min，離心后，吸取淋巴細(xì)胞放入另一15 mL離心管中，加適量Hank’s液洗滌，輕輕吹打混勻，1 500 r/min，離心5 min，棄去上清液，洗滌3次后，在沉淀物中加入適量RPMI 1640液，混勻，分成兩份，一份在45 ℃恒溫水浴保溫30 min(每隔5 min振搖1次)，以1 500 r/min離心3～5 min，棄去上清液，再加入適量RPMI 1640液，混勻后，置45 ℃恒溫水浴保溫30 min，取出后以每分鐘1 500 r/min離心5 min，棄上清液。用Hank’s液洗滌3次，再用Hank’s液適當(dāng)稀釋并計數(shù)，使最終濃度為每1 mL中5×106個細(xì)胞，為脫E受體外周血單個核細(xì)胞懸液。另一份用RPMI 1640液調(diào)節(jié)使其終濃度為5×106/mL，為未脫E受體外周血單個核細(xì)胞懸液。同時取適量綿羊血，用Hank’s液洗滌綿羊紅細(xì)胞3次。加適量Hank’s液稀釋并計數(shù)，使最終濃度為脫E受體外周血單個核細(xì)胞濃度的10倍(5×107/mL)。實驗設(shè)實驗組、陰性對照組及陽性對照組，實驗組分為4個濃度梯度，分別為1 mg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL。取6支小試管，1支陽性對照管中加未脫E受體T細(xì)胞懸液0.2 mL；1支陰性對照管中加脫E受體胸腺T細(xì)胞懸液0.2 mL；4支各加不同濃度轉(zhuǎn)移因子溶液0.1 mL作測定管，測定管中各加脫E受體胸腺T細(xì)胞懸液0.2 mL；37 ℃保溫1 h后，加入綿羊紅血球懸液0.2 mL，搖勻，以500 r/min離心3 min，放入4 ℃冰箱過夜，次日取出，棄上清液，每管中各加入0.8%戊二醛固定液0.1 mL，輕輕搖勻，靜置10 min，加入吉姆薩染色液2滴并搖勻，靜置15 min后開始計數(shù)，統(tǒng)計實驗各組的E玫瑰花環(huán)結(jié)合的細(xì)胞數(shù)求得E玫瑰花結(jié)合百分率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

將所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用方差分析軟件SPSS 19.0中的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 理化指標(biāo)的檢測

轉(zhuǎn)移因子的理化指標(biāo)均符合2008版《中國生物制品規(guī)程》的要求(表1)。

表1 豬脾轉(zhuǎn)移因子的理化性狀結(jié)果

2.2 豬脾轉(zhuǎn)移因子生物學(xué)活性檢測

2.2.1 淋巴細(xì)胞增殖試驗結(jié)果 淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)72 h后加入CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)3 h后檢測，結(jié)果顯示陽性對照(PHA)組與陰性對照組相比可以明顯促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖(P<0.05)，各實驗組與陰性對照組可以明顯促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖(P<0.05)，其中 500 μg/mL和250 μg/mL組濃度的A值較高，與陰性對照組相比差異有顯著性差異(P<0.05)，說明我們制備的TF在500 μg/mL或250 μg/mL可以明顯促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖。與陽性對照(PHA)組相比無顯著差異(P>0.05)，而1 mg/mL和125 μg/mL組的淋巴細(xì)胞增殖試驗結(jié)果和陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同濃度轉(zhuǎn)移因子對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用

*P<0.05，與陰性對照組比較。

2.2.2 E玫瑰花環(huán)形成試驗結(jié)果 各實驗組與陰性對照組E花環(huán)形成率均有化明顯增加，與陰性對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，其中500 μg/mL和250 μg/mL組，E花環(huán)形成率較高，分別為37.7%和39.1%，較陰性對照增加了17%以上。而1 mg/mL和125 μg/mL組的E花環(huán)形成率分別為27%和24.5%，低于500 μg/mL和250 μg/mL組，說明TF對T細(xì)胞的刺激作用沒有明顯的量效關(guān)系。

*P<0.05，與陰性對照組比較。

3 討論

TF的制備方法有很多種，主要有透析法、超濾法等[5-6]。透析法是制備TF常用的標(biāo)準(zhǔn)方法，它不需離心和專業(yè)的超濾設(shè)備，是一種適合實驗室生產(chǎn)TF的常用方法。超濾法是一項在壓力驅(qū)動下的膜過濾技術(shù)，是近年來隨著對生物膜機(jī)制的深入研究和認(rèn)識發(fā)展起來的一種新技術(shù)，現(xiàn)在超濾法已經(jīng)逐漸成為適于轉(zhuǎn)移因子的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的主要方法。超濾法相對透析法來說需要專業(yè)的超濾設(shè)備，而且在超濾前需要通過離心和蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)去除大分子蛋白和雜質(zhì)，生產(chǎn)步驟相對繁瑣，但它產(chǎn)率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)[10]。本實驗通過凍融-透析法成功地制備了豬脾TF，新鮮豬脾經(jīng)高速勻漿后，放入-20 ℃低溫冰箱中凍存，再進(jìn)行融化，經(jīng)透析、過濾除菌即可以制得豬脾TF，此法既簡單又經(jīng)濟(jì)，適合實驗室小量生產(chǎn)和研究[7-8]。在制備過程中發(fā)現(xiàn)，提高TF多肽含量的關(guān)鍵步驟是在于脾臟勻漿的凍融的次數(shù)，對TF的收率和質(zhì)量有很大的影響，在凍融過程中破壞細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的小分子多肽和多核甘酸完全釋放出來，凍融次數(shù)多可以提高TF多肽的含量，但是凍融次數(shù)越多，其產(chǎn)品中核糖和多肽的比值就越低，而且容易受到細(xì)菌的污染。同時因為TF在高溫下容易失去活性，所以相應(yīng)的操作步驟應(yīng)在低溫下進(jìn)行，如勻漿、透析的操作過程都應(yīng)在4℃條件下進(jìn)行。

本實驗還通過淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗檢和E花環(huán)實驗檢測制備的TF非特異性免疫學(xué)生物學(xué)活性，實驗證實制備的TF在500 μg/mL和250 μg/mL濃度下具有較好的刺激小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖的能力和較高E花環(huán)形成率。說明我們制備的豬脾TF在500 μg/mL和250 μg/mL濃度下能夠有效的增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫能力。我們所采用凍融-透析法制備豬脾TF的方法是一種有效、可行的實驗方法。目前隨著人口的老齡化，和后天性免疫缺陷病(如AIDS)的增加，在臨床上出現(xiàn)越來越多病毒性傳染病以及過敏性疾病，轉(zhuǎn)移因子作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景，并且取得了較好的效果[11-13]。

[1] 郭成留, 程會昌. 動物轉(zhuǎn)移因子及其研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，(6): 46-48.

[2] 麻娜, 周靜芳. 脈絡(luò)寧注射液聯(lián)合轉(zhuǎn)移因子口服液治療帶狀皰疹38例[J].中國藥業(yè)，2014，23(8): 72.

[3] 馬建波. 轉(zhuǎn)移因子口服液輔助治療反復(fù)呼吸道感染老年患者療效觀察[J].中國藥師，2014，(2): 260-261.

[4] 常建軍. 轉(zhuǎn)移因子的研究現(xiàn)狀及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].青海大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007，25(2): 31-35.

[5] 喬宏興, 白靜. 豬脾轉(zhuǎn)移因子的制備及臨床應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(7): 203-205.

[6] 寧豫昌, 喬宏興, 馬輝. 豬脾轉(zhuǎn)移因子的制備與生物學(xué)特性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，(7): 1612-1615.

[7] 蔣小武, 曾楊梅, 朱樂欣, 等. 鵝脾臟非特異性轉(zhuǎn)移因子的粗提取與活性鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，(5): 2710-2712.

[8] 凌紅麗, 陸承平, 王宏華, 等. 雞和豬脾轉(zhuǎn)移因子活性組分的提取及免疫活性研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2007，39(4): 14-16.

[9] 中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會.中國生物制品規(guī)程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[10]朱天新, 任晚瓊, 袁彩君. 豬脾轉(zhuǎn)移因子生產(chǎn)方法的比較[J].中國生化藥物雜志，2005，26(1):44-45.

[11]馬建波. 轉(zhuǎn)移因子口服液輔助治療反復(fù)呼吸道感染老年患者療效觀察[J].中國藥師，2014，(2): 260-261.

[12]史秀山. 轉(zhuǎn)移因子增強(qiáng)狂犬病疫苗免疫效果的研究[J].中國人獸共患病雜志，2004，20(11): 987-988,986.

[13]熊心猜, 丁小潔, 鄧?yán)?等.依匹斯汀聯(lián)合轉(zhuǎn)移因子治療慢性蕁麻疹療效觀察[J].重慶醫(yī)學(xué)，2010，39(23): 3223,3230.

(學(xué)術(shù)編輯：楊健)

本刊網(wǎng)址：http：//www.nsmc.edu.cn

作者投稿系統(tǒng)：http：//noth.cbpt.cnki.net

郵箱：xuebao@nsmc.edu.cn

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Preparation and biological activity research of porcine spleen transfer factor

DU Lian-feng，XIA Qiang，YU Yan，YANG Rui，GUO Jin-jin,SUN Wan-bang，ZHU Jin-jun

(ZunyiMedicalCollegeZhuhaiCampus，GraduateEducationandInnovationBaseofImmunologyinGuizhouProvince,Zhuhai519041,Guangdong,China)

Objective：Preparing pig spleen transfer factor by freeze thaw dialysis method,to preliminarily study the physicochemical properties,the biological activity of immunology and biological safety.Methods：Freezing and thawing fresh pig spleen by cryogenic homogenization repeatedly,getting supernatant dialysis from aseptic centrifugal homogenate of spleen tissue fluid to prepare the transfer factor.The content of polypeptide was detected respectively by modified Lowry polypeptide content;the physicochemical indexes,sterility test,pyrogen test and biological activity were detected too.Results：The physicochemical properties of pig spleen transfer factor by freeze thaw dialysis method consists with “China Biological Products” requirement;sterility test and pyrogen test are negative;safety tests is qualified;lymphocyte transformation test and E rosette formation test confirms that it has to stimulate lymphocyte proliferation biological activity.Conclusion：Successfully preparing pig spleen transfer factor,its physicochemical indexes are in line with the requirements for Biological Products,and have good biological activity of nonspecific immunology.

Transfer factor;Non-specific immunological biological activity;Physicochemical properties

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.02.10

貴州省教育廳自然科學(xué)項目(20090105)

2015-09-04

杜聯(lián)峰(1976-)，男，碩士，副教授。E-mail：8wy149842@163.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160425.1131.020.html

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