開結(jié)湯對腺嘌呤所致慢性腎衰竭模型大鼠TGF-β1、MCP-1表達(dá)的影響

肖 靖，崔瑞琴，周小平*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)(回醫(yī))學(xué)院,銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)(回醫(yī))學(xué)院 教育部生育力保持重點實驗室,銀川 750004)

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開結(jié)湯對腺嘌呤所致慢性腎衰竭模型大鼠TGF-β1、MCP-1表達(dá)的影響

肖 靖1，崔瑞琴2，周小平1*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)(回醫(yī))學(xué)院,銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)(回醫(yī))學(xué)院 教育部生育力保持重點實驗室,銀川 750004)

目的 研究開結(jié)湯對腺嘌呤所致慢性腎衰竭模型大鼠TGF-β1、MCP-1表達(dá)的影響。方法 選取60只SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組:空白對照組、模型組、開結(jié)湯低、中、高劑量治療組、尿毒清治療組,除空白組外,其余5組連續(xù)灌服腺嘌呤21 d以復(fù)制慢性腎衰竭大鼠模型，劑量均是300 mg/(kg·d)。造模成功后用開結(jié)湯、尿毒清進(jìn)行干預(yù)，治療30 d后，心臟取血檢測常規(guī)生化指標(biāo)，取大鼠腎組織,用免疫組化方法檢測TGF-β1、MCP-1的表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠血清中BUN、Scr、P的含量及腎組織中TGF-β1、MCP-1的表達(dá)顯著增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)過藥物治療,開結(jié)湯3個劑量組及尿毒清組大鼠血清中BUN、Scr、P的含量及腎組織中TGF-β1、MCP-1的表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)；開結(jié)湯3個劑量組與尿毒清組比較，低、中劑量組在降低血清BUN、Scr、P的含量及抑制TGF-β1、MCP-1在腎組織中表達(dá)方面較尿毒清組顯著(P<0.05)。結(jié)論 開結(jié)湯可以改善腎功能，保護(hù)腎臟。作用途徑是抑制TGF-β1及MCP-1在腎組織中的表達(dá)，減少炎性細(xì)胞浸潤，從而延緩腎纖維化進(jìn)程。

開結(jié)湯；慢性腎衰竭；TGF-β1；MCP-1.

慢性腎衰竭(CRF)是指各種腎臟疾病引起的緩慢進(jìn)行性腎功能損害，最后導(dǎo)致尿毒癥和腎功能完全喪失，引起一系列臨床癥狀和生化、內(nèi)分泌等代謝紊亂組成的臨床綜合征[1]。腎小球硬化、腎小管萎縮或者擴(kuò)張變形、腎間質(zhì)纖維化成為CRF主要的病理基礎(chǔ)[2]，而多數(shù)研究者在治療慢性腎衰竭時，更加注重于如何有效抑制腎臟纖維化的進(jìn)程。有研究[3]報道,TGF-β1與MCP-1在促進(jìn)腎臟病理改變，加重腎臟纖維化的過程中起到重要的作用。本課題研究通過復(fù)制CRP動物模型，應(yīng)用《傷寒雜病論》中經(jīng)方“桂枝茯苓枳實芍藥甘草湯”加減,并重新命名為“開結(jié)湯”進(jìn)行藥物干預(yù)治療，觀察CRF大鼠腎組織中TGF-β1、MCP-1的表達(dá)情況，從而探討開結(jié)湯抑制慢性腎衰竭時腎臟纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動物 SD雄性大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量(250±30)g。由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(寧)2011-0001。飼養(yǎng)溫度：(26±1)℃，相對濕度：60%。

1．2 藥物 開結(jié)湯組成：桂枝、茯苓、枳實、生白芍、炙甘草。由本校藥學(xué)系中藥制備教研室加工、濃縮成1 g/mL(每mL含1 g生藥)，用時用蒸餾水配制成所需濃度。尿毒清顆粒：5g/袋，康臣藥業(yè)(內(nèi)蒙古)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20073256。用時用蒸餾水配制。腺嘌呤(C5H5N5)，上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司生產(chǎn)，用時用生理鹽水配成所需濃度的腺嘌呤混懸液。以上藥物置于4 ℃冰箱備用。

1．3 試劑與儀器 TGF-β1試劑盒(北京博奧生物有限公司)；MCP-1試劑盒(北京博奧生物有限公司)；DAB顯色液試劑(北京博奧森生物有限公司)；RM2015石蠟切片機(jī)(德國萊卡)；Eppendorf-5430離心機(jī)(德國)；DSHZ-300型恒溫水浴箱(江蘇太倉醫(yī)用儀器廠)；Image-Pro Plus多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics 公司)；352型酶標(biāo)儀(芬蘭:Labsystems Multiskan MS)。

1．4 造模及分組 參照文獻(xiàn)[4-5]方法造模:在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上將60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組：空白對照組、模型組、開結(jié)湯低、中、高劑量治療組、尿毒清治療組，每組各10只大鼠。除空白組外其他5組灌服300 mg/(kg·d)的腺嘌呤，正常組灌服蒸餾水(10 mL/kg)，連續(xù)灌胃21 d。造模期間大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1．5 給藥方式 按照人與大鼠用藥劑量折算得出大鼠灌胃劑量：開結(jié)湯低劑量組3．1 g/(kg·d)、中劑量組6．3 g/(kg·d)、高劑量組12．6 g/(kg·d)，尿毒清組2．63 g/(kg·d)，模型對照組與正常對照組按照10 mL/kg的劑量灌服蒸餾水，連續(xù)灌胃30 d，治療期間大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1．6 觀察指標(biāo) 治療結(jié)束后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，剖開大鼠胸腔，暴露心尖，用一次性真空采血管抽取心臟血(5 mL)，將收集到的心臟血高速離心分離出血清，用全自動生化分析儀檢測Scr、BUN、P等指標(biāo)；剖取雙腎，觀察腎臟大小、質(zhì)地、顏色后迅速置于4%多聚甲醛液中固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、常規(guī)切片，按照TGF-β1、MCP-1試劑盒的操作步驟進(jìn)行免疫組化實驗。采用Image-Pro Plus 6．0 圖像分析系統(tǒng)對各組標(biāo)本予圖像采集并處理分析，每張切片于高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇10個視野，以棕黃色染色表達(dá)為陽性。

2 結(jié)果

2．1 血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較

注:與模型組比較，#P<0．05，##P<0．01；與尿毒清組比較，△P<0．05，△△P<0．01

2．2 TGF-β1免疫組化顯色情況 正常組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中有少量TGF-β1表達(dá)，著色較淺，髓質(zhì)未見表達(dá)，無陽性著色；與正常對照組大鼠相比，模型組腎小管上皮細(xì)胞和髓質(zhì)的TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯增加，呈極強(qiáng)陽性表達(dá)，著色極深；開結(jié)湯3個劑量組中，高劑量組大鼠腎小球、腎間質(zhì)、腎小管著色較低、中劑量組變深；開結(jié)湯組與尿毒清組比較，低、中劑量組在抑制TGF-β1在腎組織中表達(dá)的效果優(yōu)于尿毒清組。

2．3 MCP-1免疫組化顯色情況 MCP-1在正常組腎小球、腎間質(zhì)、腎小管有極少量表達(dá)，著色淺；模型組腎小球、腎間質(zhì)、腎小管著色明顯較正常組深；開結(jié)湯3個劑量及尿毒清組腎小球、腎間質(zhì)、腎小管著色較模型組明顯變淺，說明其表達(dá)量降低；開結(jié)湯3個劑量組與尿毒清組比較，低、中劑量組腎小球、腎小管、腎間質(zhì)著色較淺，說明低、中劑量范圍內(nèi)的開結(jié)湯在降低腎組織中MCP-1的表達(dá)方面較尿毒清組顯著。

2．4 各組大鼠腎組織TGF-β1及MCP-1 OD值比較 見表2。

組 別TGF-β1MCP-1正常組 0.10±0.21 0.15±0.21 開結(jié)湯低劑量組0.14±0.48#△▲0.32±1.62#△▲開結(jié)湯中劑量組0.12±0.28#△▲0.22±0.55#△▲開結(jié)湯高劑量組0.25±1.48#△ 0.49±2.30#△ 尿毒清治療組 0.20±1.08#△ 0.34±1.18#△ 模型組 10.45±1.83## 0.52±6.19##

注:與正常組比較，#P<0．05，##P<0．01；與模型組比較，△P<0．05；與尿毒清組比較，▲P<0．05

3 小結(jié)

本課題應(yīng)用腺嘌呤造成CRF模型，模型組大鼠腎組織中TGF-β1、MCP-1在腎小管及腎間質(zhì)的表達(dá)較正常組顯著；經(jīng)過藥物干預(yù)治療，與模型組比較,開結(jié)湯3個劑量組與尿毒清治療組血清Scr、BUN、P的含量均降低，說明藥物治療可以改善腎功能,免疫組化結(jié)果顯示開結(jié)湯3個劑量組及尿毒清組大鼠腎組織中TGF-β1、MCP-1的表達(dá)較模型組降低；開結(jié)湯3個劑量組與尿毒清組比較，開結(jié)湯低、中劑量組在降低血清Scr、BUN、P的含量方面優(yōu)于尿毒清組，且低、中劑量的開結(jié)湯通過抑制腎組織中TGF-β1、MCP-1的表達(dá)，從而抑制腎組織纖維化，延緩腎衰竭進(jìn)程[6-12]。

開結(jié)湯中桂枝溫陽發(fā)汗，還可散下焦蓄血[13]，藥理研究[14]認(rèn)為桂枝還具有抗血小板聚集和體內(nèi)抗血栓的作用；芍藥主入肝經(jīng),可降低血清中TGF-β1、玻璃酸、Ⅲ型前膠原和層黏蛋白的含量以及肝組織中羥脯氨酸含量，減輕肝損傷程度和膠原纖維增生程度[15]；枳實理氣消滯，具有抗血小板聚集及抑制紅細(xì)胞聚集的作用[16]；茯苓健脾利水；甘草調(diào)和諸藥[17]。本方活血行氣力強(qiáng)，能很好的抑制腎纖維化的發(fā)生，改善腎功能，同時不忘健脾利水，調(diào)理臟腑氣機(jī)，糾正機(jī)體水液代謝紊亂,抑制炎癥發(fā)生,減少TGF-β1、MCP-1等細(xì)胞因子的表達(dá)，提高腎功能，抑制腎衰竭的進(jìn)一步發(fā)生。

綜上所述，開結(jié)湯具有很好的抗纖維化作用，抑制炎性細(xì)胞浸潤減少TGF-β1、MCP-1在腎組織中表達(dá)，延緩腎衰竭的進(jìn)一步發(fā)展。

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Kaijie decocition on adenine induced chronic renal failure model in rats TGF-β1 and MCP-1 expression

XIAO Jing1,CUI Ruiqin2,ZHOU Xiaoping1*

(1.College of Traditional Chinese (hui) Medicine,Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.College of Traditional Chinese (hui) Medicine,Ningxia Medical University/ Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education,Yinchuan 750004,China)

Objective To study the effect of Kaijie decoction on adenine induced chronic renal failure model in rats TGF-β1 and MCP-1 expression.Methods The 60 rats were selected and divided randomly for 6 groups:control group,model,Kaijie decocition in the treatment of low dose treatment,medium dose treatment,high dose treatment and Niaoduqing group,in addition to the control group,the other 5 groups were treated with D/300mg/kg adenine for 21 days to make the model of CRF,after the success of the model were administered to Kaijie decocition and Niaoduqing for 30 days.After the treatment,routine biochemical indexes of cardiac blood sampling and the renal tissues were made pathological sections to study TGF-β1 and MCP-1 expression factors.Results Compared with the normal group,the content of BUN,Scr,P in serum and the expression of TGF-β1,MCP-1 in renal tissue were significantly higher than that in the model group,the difference was statistically significant (P<0.05);after drug treatment,Kaijie decocition three dose groups and Niaoduqing group serun levels of BUN,Scr,P and TGF-β1,MCP-1 in renal tissue were lower than the model group (P<0.05);compared with Naoduqing group,low and middle dose of Kaijie decocition in reducing the content of serum BUN,Scr,P and inhibition of the expression of TGF-β1,MCP-1 in renal tissue were more significantly than Naoduqing group.Conclusion Kaijie decocition through inhibition of the expression of TGF-β1 and MCP-1 in kidney tissue,delay the progression of renal fibrosis,inflammatory cell infiltration,improve renal function and renal protection.

Kaijie decoction;chronic renal failure;TGF-β1;MCP-1

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.007

國家自然科學(xué)基金“補(bǔ)益營衛(wèi)方對衰老表皮穩(wěn)態(tài)性影響的機(jī)制研究”(81460729)。

肖 靖(1990-)，女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥治療腎臟疾病的研究。

R285.5

A

2095-6258(2016)06-1119-04

2016-06-07)

*通信作者：周小平，電話-13896563103，電子信箱-191008380@qq.com