芪藶強(qiáng)心膠囊改善柔紅霉素心臟毒性的體外實(shí)驗(yàn)

李曉輝，王亞君，張國(guó)利，張劍白

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，哈爾濱 150001)

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芪藶強(qiáng)心膠囊改善柔紅霉素心臟毒性的體外實(shí)驗(yàn)

李曉輝，王亞君，張國(guó)利，張劍白

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，哈爾濱 150001)

目的 探討芪藶強(qiáng)心對(duì)柔紅霉素心臟毒性的預(yù)防和治療作用研究。方法 收集32只體外分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，凋亡試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶(HBDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等蛋白的表達(dá)；采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定血清腦鈉肽(BNP)。結(jié)果 芪藶強(qiáng)心的體外實(shí)驗(yàn)中4組研究對(duì)象的心肌細(xì)胞凋亡率存在明顯差異(P<0．05)；4組研究對(duì)象的LDH、HBDH、CK、CK-MB、SOD、MDA存在明顯差異(P<0．05)；芪藶強(qiáng)心對(duì)DNR心臟毒性預(yù)防作用中4組研究對(duì)象的心肌和血清中LDH、HBDH、CK、CK-MB、SOD、MDA存在明顯差異(P<0．05);芪藶強(qiáng)心對(duì)DNR心臟毒性治療中的3組研究對(duì)象的LVESD、LVEDD、LVEF、FS存在明顯差異(P<0．05)；且3組研究對(duì)象的BNP存在明顯差異(P<0.05)。結(jié)論 芪藶強(qiáng)心可以有效的預(yù)防和治療柔紅霉素心臟毒性，對(duì)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的輔助治療起到重要作用。

芪藶強(qiáng)心；紅霉素；心臟毒性；細(xì)胞凋亡率；血清腦鈉肽

急性白血病是造血系統(tǒng)的惡性疾病，在我國(guó)小兒惡性腫瘤中以白血病的發(fā)病率最高[1]。柔紅霉素(DNR)、阿霉素等蒽環(huán)類抗腫瘤藥物被廣泛的應(yīng)用于兒童白血病的治療，對(duì)于改善兒童白血病病情起到重要的作用[2],但易誘發(fā)心臟毒性導(dǎo)致心肌功能損傷[3]。本研究分析芪藶強(qiáng)心對(duì)DNR誘導(dǎo)心肌損傷的保護(hù)和治療作用。以期進(jìn)一步證實(shí)芪藶強(qiáng)心具有預(yù)防和治療DNR心臟毒性、保護(hù)心肌的作用，進(jìn)一步為芪藶強(qiáng)心應(yīng)用于白血病的輔助治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 選取雄性大鼠80只，體質(zhì)量(201．2±18．9) g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM培養(yǎng)液(廣州市左克生物技術(shù)有限公司提供)；胎牛血清(賽業(yè)生物科技集團(tuán)提供)；Ⅱ型膠原酶(上海玉博生物科技有限公司提供)；胰蛋白及酶基質(zhì)膠與Mdivi-1(美國(guó)Sigma公司)；LDH、HBDH、CK、CK-MB、SOD、MDA、BNP試劑盒(上海玉博生物科技有限公司提供)；芪藶強(qiáng)心、柔紅霉素購(gòu)于杭州海瑞化工有限公司。

1．2 方法

1．2．1 心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取1～3 d SD大鼠，消毒皮膚，取出心臟，PBS液清潔2次后剪成1 mm3大小的組織塊，加胰酶反復(fù)消化5次，加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，制成細(xì)胞懸液，按細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)方法，心肌細(xì)胞在含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)[4]。

1．2．2 芪藶強(qiáng)心的體外實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞分別加入4個(gè)培養(yǎng)瓶中，每瓶各10 mL,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，實(shí)驗(yàn)分4組：空白對(duì)照組、DNR組、芪藶強(qiáng)心干預(yù)組(DNR+芪藶強(qiáng)心)，芪藶強(qiáng)心對(duì)照組，其中對(duì)照組為心肌細(xì)胞中加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)液。光鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。按試劑盒操作步驟進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。1．2．3 SD大鼠的飼養(yǎng)和分組給藥[5]選擇8～10周，健康雄性SD 大鼠，分為4組，每組8只。對(duì)照組：經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水1．0 mL/kg，1次/3 d，共6次。柔紅霉素組：經(jīng)尾靜脈注射柔紅霉素2．0 mg/kg，1次/3 d，共6次。芪藶強(qiáng)心組：給予芪藶強(qiáng)心膠囊生藥(1 g/kg。以0．9%氯化鈉溶液溶為2.0 g/mL懸濁液)灌胃，1次/d，共18次。柔紅霉素+芪藶強(qiáng)心組：給藥同柔紅霉素組和芪藶強(qiáng)心組。于柔紅霉素注射前(第0天)及注射后第6、12、18天，即在柔紅霉素累計(jì)0、4、8、12 mg/kg時(shí)，經(jīng)眶靜脈取血測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿心肌酶譜活性及MDA含量、SOD活性。

1．2．4 芪藶強(qiáng)心對(duì)DNR心臟毒性治療研究 隨機(jī)將16只SD大鼠造模[6]。造模的大鼠在2周內(nèi)，分6 次對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射阿霉素215 mg/kg (阿霉素用0．9%氯化鈉溶液溶解為2 mg/mL的溶液)；正常對(duì)照組的大鼠進(jìn)行腹腔注射同等劑量的0．9%氯化鈉溶液。所有大鼠自末次注射后進(jìn)行觀察2周。將成模后的大鼠隨機(jī)分為3組：心衰組、芪藶強(qiáng)心組、美托洛爾組。芪藶強(qiáng)心組每天給予芪藶強(qiáng)心膠囊生藥(1 g/kg，以0．9%氯化鈉溶液溶為2 g/mL懸濁液)進(jìn)行灌胃；美托洛爾組以10 mg/kg(將藥片碾碎用0．9%氯化鈉溶液溶為2 mg/mL懸濁液)進(jìn)行灌胃；心衰組和正常對(duì)照組以同等體積0．9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃，持續(xù)時(shí)間為6 周。

1．3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1．3．1 血清腦鈉肽(BNP)的測(cè)定[7]按大鼠BNP ELISA 試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定BNP含量。

1．3．2 TUNEL法檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率[8]收集大鼠心肌活細(xì)胞，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1．3．3 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)LDH、HBDH、CK、CK-MB、SOD、MDA等蛋白的表達(dá)[9]心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)處理后，采用Bcl-2抗體，37 ℃孵育24 h，棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，然后用蛋白裂解液使細(xì)胞裂解，冰上放置5 min后，收集細(xì)胞裂解液并煮沸25 min，用SDS-PAGE進(jìn)行電泳，并將其轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素(NC)膜上。對(duì)抗體孵育處理，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法曝光后觀察結(jié)果。

1．3．4 心臟超聲評(píng)價(jià)心功能 檢測(cè)指標(biāo)主要包括LVESD、LVEDD、LVEF和FS[10]。

2 結(jié)果

2．1 芪藶強(qiáng)心的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1。

2．2 芪藶強(qiáng)心對(duì)DNR心臟毒性預(yù)防作用的結(jié)果 見(jiàn)表2。

2．3 芪藶強(qiáng)心對(duì)DNR心臟毒性治療的結(jié)果 見(jiàn)表3。

表1 4組心肌細(xì)胞凋亡率和LDH、HBDH、CK、CK-MB、SOD、MDA含量比較

注:與空白對(duì)照組比較，#P<0．05；與芪藶強(qiáng)心對(duì)照組比較，△P<0．05；與DNR組比較，▲P<0．05

表2 4組心肌和血清中LDH、HBDH、CK、CK-MB、SOD、MDA含量比較

注:與空白對(duì)照組比較，# P<0．05；與柔紅霉素組比較，△ P<0．05；與芪藶強(qiáng)心組比較,▲ P<0．05

表3 3組LVESD、LVEDD、LVEF、FS和BNP比較

注:與心衰組比較，#P<0．05；與芪藶強(qiáng)心組比較，△P<0．05

3 小結(jié)

研究[11]表明，蒽環(huán)類藥物對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用有直接和間接種形式，不僅可以抑制心肌細(xì)胞的氧化磷酸化，使機(jī)體心肌細(xì)胞發(fā)生變性、炎癥滲出，嚴(yán)重者可引起心肌收縮力的減弱，從而發(fā)生心力衰竭等。芪藶強(qiáng)心膠囊可以通過(guò)協(xié)同或互補(bǔ)作用，起到強(qiáng)心、利尿及擴(kuò)血管的作用[12]。廣泛用于治療冠心病、高血壓所引起的心力衰竭。其作用機(jī)理可降低阿霉素誘導(dǎo)的心肌病的TNF2α水平，抑制炎性因子對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用，從而起到改善心功能的功效。本研究結(jié)果顯示，芪藶強(qiáng)心可以有效預(yù)防和治療柔紅霉素心臟毒性，對(duì)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的輔助治療起到重要作用。

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Preventive and therapeutic effect of Qiliqiangxin on daunorubicin cardiotoxicity

LI Xiaohui,WANG Yajun,ZHANG Guoli,ZHANG Jianbai

(Department of Paediatrics,The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China)

Objective To study the preventive and therapeutic effect of Qiliqiangxin on daunorubicin cardiotoxicity.Methods Collected 32 cultured myocardial cells of neonatal rats,the morphological changes of myocardial cells were observed under microscope,TUNEL method to detect apoptosis rate,the protein immunoblot (Western blot) assay for the detection of LDH,HBDH,CK,CK-MB,SOD and MDA protein expression;by electrochemiluminescence immunoassay method for the determination of serum brain natriuretic peptide (BNP).Results Qili Qiangxin in vitro experiments in four groups of myocardial cell apoptosis rate had significant difference (P< 0.05);four groups of LDH,HBDH CK,CK-MB,SOD,MDA had obvious difference (P<0.05);Qili Qiangxin to DNR cardiac toxicity prevention role in 4 groups of research object of myocardium and serum LDH,HBDH,CK,CK-MB,SOD,MDA had significant difference (P<0.05);Qili Qiangxin to DNR cardiac toxicity in the treatment of 3 groups of LVESD and LVEDD,LVEF,FS had obvious difference (P<0.05);and group 3 research object of BNP had obvious difference (P<0.05).Conclusion Qiliqiangxin is effective for prevention and treatment of soft erythromycin cardiac toxicity,adjuvant therapy for children with acute lymphoblastic leukemia (all) will play a important role.

Qiliqiangxin;erythromycin;cardiac toxicity;apoptosis rate;serum brain natriuretic peptide

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.006

黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目“芪藶強(qiáng)心對(duì)柔紅霉素心臟毒性的預(yù)防和治療作用研究”(ZHY12-Z147)。

李曉輝(1969-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事小兒血液系統(tǒng)疾病研究。

R285.5

A

2095-6258(2016)06-1116-03

2016-06-08)