蒜頭果蛋白的紅外光譜及圓二色譜分析

袁 燕，梅雙喜

(1.云南民族大學民族醫藥學院，民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南昆明 650500;2.云南白藥集團創新研發中心，云南昆明 650500)

?

蒜頭果蛋白的紅外光譜及圓二色譜分析

袁 燕1，梅雙喜2

(1.云南民族大學民族醫藥學院，民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南昆明 650500;2.云南白藥集團創新研發中心，云南昆明 650500)

[目的]研究蒜頭果蛋白微觀結構與其抗腫瘤活性的關系。[方法]采用紅外光譜及圓二色譜等方法研究蒜頭果蛋白微觀結構的變化。 [結果]蒜頭果蛋白在順式構型狀態下較穩定，是一種α+β型蛋白質。[結論]試驗結果為進一步研究蒜頭果蛋白的結構與功能奠定了基礎。

蒜頭果蛋白；紅外光譜；圓二色譜

蒜頭果(MalaniaoleiferaChun et S.Lee)屬于鐵青樹科蒜頭果屬[1]。蒜頭果蛋白是從蒜頭果中分離出來的具有抗腫瘤活性的糖蛋白。蒜頭果蛋白具有明顯抑制人宮頸癌HeLa、神經瘤PC-12、人乳腺癌MCF-7、人白血病K562等腫瘤細胞體外增殖的能力[2]。由于其結構尚未知，筆者采用紅外光譜、圓二色譜等方法分析蒜頭果蛋白微觀結構的變化，旨在為進一步研究其結構與抗腫瘤活性功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 材料與試劑。蒜頭果蛋白樣品由云南大學教育部自然資源藥物化學重點實驗室制備；化學試劑均為國產分析純。1.1.2 主要儀器。Avatar-360型傅立葉變換紅外光譜儀(Nicolet公司)； JASCO-815型圓二色譜儀(日本分光JASCO公司)。

1.2 方法

1.2.1 紅外光譜測定。將蒜頭果蛋白干粉和溴化鉀混合研磨后壓片，于Avatar-360型傅立葉變換紅外光譜儀測定紅外光譜[3-4]。

1.2.2 圓二色譜測定。將0.15 mg/mL蒜頭果蛋白溶液在JASCO-815型圓二色譜儀上測定圓二色譜。測試條件：樣品池厚0.1 cm，掃描范圍190～350 nm，掃描速度200 nm/min，光程分別為0.50、0.02 cm，靈敏度為2毫度/cm[5-6]。圓二色譜用平均橢圓度[θ]表示，單位為deg·cm2/dmol，并按Chen等[7]的方法計算各構象單元含量。

2 結果與分析

2.1 紅外光譜分析 肽鍵是一種酰胺鍵，它在紅外光區有特征的吸收峰。1 720～1 600 cm-1是酰胺I的吸收峰；1 450～1 550 cm-1是酰胺Ⅱ的吸收峰；1 330～1 200 cm-1是酰胺Ⅲ的吸收峰。蛋白質主鏈的構象主要由酰胺I和酰胺Ⅲ的特征峰確定，酰胺I的特征峰是碳基在平面內的伸縮振動加上少量的N-H平面內的彎曲振動的結果[8]，肽鏈官能團-H-N-C=O的特征吸收譜帶1 538.83 cm-1和1 400.35 cm-1，分別是-HN-C=O的反式構型和順式構型的吸收峰[9]。

圖1為蒜頭果蛋白在干粉狀態下的紅外光譜，其吸收峰的歸屬見表1。由圖1可知，反式吸收(1 400.35 cm-1)強于順式吸收(1 538.83 cm-1)，說明蒜頭果蛋白在順式構型狀態下較穩定。

圖1 蒜頭果蛋白的紅外光譜Fig.1 The infrared spectroscopy of malanin

由于酰胺Ⅲ區可以反映蛋白質的二級結構信息，且不受水分子的干擾[10]，各種二級結構的酰胺Ⅲ帶振動區域如下：1 340～1 290 cm-1為α-螺旋結構；1 288～1 255 cm-1為無規則卷曲結構；1 248～1 220 cm-1為β-折疊結構[11]。從蒜頭果蛋白的紅外光譜圖中可以看出，在1 240.63 cm-1處有紅外吸收峰屬于β-折疊結構；在1 310.23 cm-1處有紅外吸收峰屬于α-螺旋結構，根據二者吸收峰的相對強度，表明在蒜頭果蛋白中β-折疊結構所占的比例大于α-螺旋結構。

表1 蒜頭果蛋白酰胺基團的特征振動

圖2 蒜頭果蛋白在不同pH下的CD圖譜Fig.2 The CD map of malanin under different pH

2.2 圓二色譜分析 圖2為在pH5.0、6.0、7.0和8.0溶液狀態下，蒜頭果蛋白的圓二色譜(CD譜)。圖2結果表明，在上述4種不同pH條件下，pH 6.0、pH 7.0和pH 8.0的CD譜相差不大，摩爾橢圓度[θ]分別為-9.481×10+3、-10.044×10+3、-10.378 3×10+3deg·cm2/dmol，pH 5.0的CD譜的摩爾橢圓度[θ]為-7.534×10+3deg·cm2/dmol，均在192 nm處有1個正峰，在208和222 nm處有2個負槽，208 nm比222 nm的CD值數據要大，但峰的負值不大，說明蒜頭果膠白中α-螺旋和β-折疊都含有，是一種α+β型蛋白。 由表2可知，蒜頭果蛋白中β-折疊的含量大于α-螺旋，但這2種結構都大于15.0%，說明蒜頭果蛋白應該是一種α+β型蛋白質。

表2 蒜頭果蛋白的二級結構

3 結論

由于蒜頭果蛋白的結構還未知，該研究采用紅外光譜、圓二色譜的方法分析蒜頭果蛋白微觀結構的變化。蒜頭果蛋白的紅外光譜圖顯示其反式吸收(1 400.35 cm-1)強于順式吸收(1 538.83 cm-1)，說明蒜頭果蛋白在順式構型狀態下較穩定；在不同pH條件下測得的圓二色譜圖并按Chen等[7]的方法進行計算，結果發現蒜頭果蛋白中β-折疊的含量均大于α-螺旋，但這2種結構都大于15%，說明蒜頭果蛋白應該是一種α+β型蛋白質。試驗結果為進一步研究蒜頭果蛋白的結構與抗腫瘤活性功能奠定了基礎。參考文獻

[1] 丘華興，林有潤.中國植物志：二十四卷[M].北京：科學出版社，1988：89.

[2] YUAN Y，DAI X C，WANG D B，et al.Purification，characterization and cytotoxicity of malanin，a novel plant toxin from the seeds ofMalaniaoleifera[J].Toxicon，2009，54(2)：121-127.

[3] 李建蕊，陳建波，周群，等.中藥三七不同部位和組織的紅外光譜分析[J].光譜學與光譜分析，2014，34(3)：634-637.

[4] 杜娟，彭惜媛，馬芳，等.黑豆和牽牛子紅外光譜的分析與鑒定[J].光譜學與光譜分析，2014，34(9)：2429-2433.

[5] 陳格飛，賈小娜，鄭翔宇，等.重組蜘蛛絲蛋白MiSp NT結構域在不同pH環境下的Trp熒光光譜及圓二色譜分析[J].中國生物化學與分子生物學報，2014，30(1)：68-74.

[6] 席加富，唐蕾，張建華，等.圓二色譜表征芥藍抗壞血酸過氧化物酶變性過程中的結構變化[J].光譜學與光譜分析，2014，34(11)：3062-3065.

[7] CHEN Y H,YANG J T,CHAU K H.Determination of the helix and β form of proteins in aqueous solution by circular dichroism[J].Biochemistry,1974,13(16):3350-3359.

[8] 柯惟中，余鄉慰.胰蛋白酶溶液的激光拉曼譜[J].光散射學報，1995(Z1)：159.

[9] 周瑞明，沈永嘉.蛋白質二級結構的紅外光譜[J].華東理工大學學報，1997，23(4)：422- 425.

[10] FU F N，DEOLIVERIRA D B，TRUMBLE W R，et al.Secondary structure estimation of proteins using the amide Ⅲ region of fourier transform infrared spectroscpy:Application to analyze calcium-binding-induced structural changes in colsequestrin[J].Applied spectroscopy，1994，48(11)：1432-1441.

[11] 李正強，陶艷春，王永婷.單鏈核糖體失活蛋白的Raman和紅外光譜[J].光散射學報，2000，11(4)：335-337.

Infrared Spectroscopy and Circular Dichroism Spectrum of Malanin

YUAN Yan1, MEI Shuang-xi2

(1. Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources, State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education, Yunnan Minzu University, Kunming, Yunnan 650500; 2. Innovation Research and Development Center of Yunnan Baiyao Group, Kunming, Yunnan 650500)

[Objective] The relationship between microstructure and anti-tumor activities of malanin were analyzed. [Method] We studied the microstructure of malanin by infrared spectra and circular dichroism. [Result] Malanin had more stable state in the cis-configuration, and it was a protein with α+β type. [Conclusion] The results lay the foundation for further research on the structure and anti-tumor activities function of malanin.

Malanin; Infrared spectroscopy; Circular dichroism spectrum

國家自然科學基金項目(81260500)。

袁燕( 1975- )，女，江西分宜人，副教授，博士，碩士生導師，從事生物有機化學研究。

2016-09-09

S 727.34;O 433.4

A

0517-6611(2016)33-0116-02