1個廣譜抗真菌天然產物的快速鑒定及活性評價

萬中義,張亞妮,張志剛,黃大野,王開梅,楊自文

(湖北省生物農藥工程研究中心/湖北農業科技創新中心生物農藥分中心，湖北武漢 430064)

Note:9.Complete inhibition; 7.Most inhibition.

Note:9.Complete inhibition; 7.Most inhibition; 3.Part inhibition; 0.No inhibition.

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1個廣譜抗真菌天然產物的快速鑒定及活性評價

萬中義,張亞妮,張志剛,黃大野,王開梅*,楊自文

(湖北省生物農藥工程研究中心/湖北農業科技創新中心生物農藥分中心，湖北武漢 430064)

[目的]對湖北咸寧地區山坡土樣中分離得到的1株放線菌HBERC-31270的發酵提取物進行快速鑒定及活性評價。[方法]對HBERC-31270進行發酵與提取，并對發酵提取物進行生物活性測定、高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)、紫外吸收光譜(UV)分析及活性評價。[結果]提取物高效液相色譜(HPLC)制備組分活性測定結果表明，其活性部位在14～21 min。根據HPLC-MS及UV確定其主要成分為一個小分子化合物。通過對其質譜數據進行分析確定了分子離子峰，經天然產物數據庫比對及文獻調研，確定其主要活性成分為9-甲基鏈米酮。盆栽試驗結果表明，該菌對多種作物真菌性病害具有較好的防治效果。[結論]試驗結果為放線菌HBERC-31270的進一步研究提供了理論依據。

天然產物；農藥活性；放線菌；9-甲基鏈米酮

在生物農藥的研究開發工作中，放線菌產生的天然產物是其重要的來源[1-2]。一方面，放線菌可直接通過發酵及后處理制成生物農藥，如阿維菌素[3-5]、多殺菌素[6]、井岡霉素[7-8]等；另一方面，以天然產物為模板，對其結構進行優化改造，是研發高效低毒綠色農藥的另一途徑，如甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[9]就是以擔子菌產生的strobilurin[10]為先導化合物經人工改造而獲得。隨著人們對環境中微生物資源的不斷挖掘，重復發現已知化合物的概率越來越高，獲得新活性化合物的難度越來越大。因此，從大量樣品中對活性化合物進行快速鑒定成為發現新化合物的關鍵。

HBERC-31270是湖北省生物農藥工程研究中心在天然產物篩選過程中，從湖北咸寧地區采集的土樣中分離出的1株放線菌，經生物活性測定，其發酵提取物對多種農業真菌病原具有強烈的抑制活性。筆者對其發酵提取物進行制備及收集，獲得了不同時間流出的樣品共36份，通過生物測定確定其活性成分部位，通過高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)分析、天然產物數據庫比對及文獻調研對活性產物的化學結構進行了快速鑒定，并通過盆栽試驗對其進行了生物活性評價，以期為該菌的進一步研究與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。放線菌HBERC-31270分離自湖北咸寧采集的山坡樹林根際土，土樣編號為S-1699，由湖北省生物農藥工程研究中心分離保藏。農藥活性測定用指示真菌包括番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea，BOTCIN)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani，RHISOL)、黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum，FUSCUL)、小麥穎枯病菌(Septorianodorum，SEPNOD)、番茄早疫病菌(Alternariasolani，ALTSOL)、蠶豆銹病菌(Uromycesfabae，UROFAB)。

1.1.2 培養基。斜面培養基：ISP-2培養基。采用18 mm×180 mm 玻璃試管，每管裝瓊脂培養基8～10 mL。種子培養基：同ISP-2，不加瓊脂。采用500 mL帶擋板三角瓶，每瓶裝培養基100 mL,121 ℃滅菌30 min。發酵培養基：主要成分為葡萄糖、棉籽蛋白、酵母浸粉等。采用500 mL帶擋板三角瓶，每瓶裝培養基100 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要儀器與數據庫。Ly-0.8型冰凍干燥機，上海東富龍科技有限公司生產；Waters高效制備液相色譜儀(Waters 2525泵，帶2767自動收集系統，2996二極管陣列式檢測器)；液相色譜-質譜聯用儀，采用Waters 2695高效液相色譜儀(Waters 2996 二極管陣列式檢測器)、Micromass Quattro micro?質譜儀(電噴霧離子源ESI)以及Masslynx V4.1液質聯用分析軟件；查普曼天然產物數據庫2003版。

1.2 方法

1.2.1 菌株搖瓶發酵。從斜面取8～10 mm的1塊菌苔轉移至種子搖瓶中，置于28 ℃、150 r/min旋轉式搖床上振蕩培養72～96 h，按10%(V/V)的接種量轉接至發酵培養基中，置于28 ℃、150 r/min旋轉式搖床上振蕩培養100～120 h，即完成發酵。

1.2.2 發酵液凍干與提取。將發酵液轉移至不銹鋼凍干盒中，置于凍干機中冰凍干燥，凍干條件為：-40 ℃預凍2 h，將冷阱預冷至-45 ℃以下，然后開啟真空泵升華。真空度為50～90 Pa，升溫速率為2～3 ℃/h，極限溫升為37 ℃。凍干完成后，轉移至三角瓶中，先用少量50%甲醇-水濕潤，再加入100 mL乙酸乙酯，于搖床上180 r/min振蕩萃取1 h，分離出乙酸乙酯相，旋轉蒸發，除去溶劑，以少量甲醇溶解，12 000 r/min離心3 min，取上清液送HPLC-MS分析。

1.2.3 提取物生物活性測定。取一定量發酵提取物，加入乙醇溶解，以純水稀釋至一定濃度后，用96孔板進行生物活性測試。組分活性測試采用相同的靶標及方法。

1.2.4 提取物液質聯用分析。色譜柱為美國Sunfire C18柱，150.0 mm×2.1 mm(i.d)，粒徑為3.5 μm，柱溫為40 ℃，進樣量為2 μL，流動相為超純水和色譜純乙腈，梯度洗脫。質譜檢測條件：電噴霧電離(ESI)，毛細管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為70 V，離子源溫度為100 ℃，干燥氣溫度為300 ℃,脫溶劑氣體流速為500 L/h，錐孔氣體流速為50 L/h。

1.2.5 提取物鑒定。根據組分活性測定結果，確定活性成分的保留時間，從高效液相色譜(HPLC)中精確提取活性物質的紫外吸收光譜，確定吸收峰的波長。從正、負離子流圖譜中可判定目標產物的分子離子峰。將吸收峰波長及分子量輸入Chapman天然產物數據庫，查詢同該物質性質相同或相近的化合物名稱及其結構式，通過理化及生物學性質，確定活性化合物的種類及結構式。

1.2.6 發酵液室內活性評價。采用對峙法。

抑菌率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑-菌餅直徑)×100%

1.2.7 發酵液盆栽活性評價。采用小麥、蠶豆、番茄幼苗，進行HBERC-31270發酵液的盆栽活性評價。供試幼苗均在室內培養14 d左右。將發酵液加入0.1%吐溫-80后噴于幼苗葉面，24 h后接入病原菌孢子。以清水加0.1%吐溫-80為空白對照，7 d后進行調查。

分級方法：0級，葉片無病斑；1級，病斑面積占葉片面積的5%以下；3級，病斑面積占葉片面積的6%～10%；5級，病斑面積占葉片面積的11%～20%；7級，病斑面積占葉片面積的21%～50%；9級，病斑面積占葉片面積的50%以上。

2 結果與分析

2.1 HBERC-31270發酵提取物的農藥活性 從表1、2可知，具有抗真菌活性的組分出現在14～21 min，其余組分無活性。

表1 HBERC-31270粗提物農藥活性

注：9表示完全抑制；7表示大部分抑制。

Note:9.Complete inhibition; 7.Most inhibition.

表2 HBERC-31270制備組分活性

注：9表示完全抑制；7表示大部分抑制；3表示部分抑制；0表示無活性。

Note:9.Complete inhibition; 7.Most inhibition; 3.Part inhibition; 0.No inhibition.

2.2 HBERC-31270提取物的HPLC及紫外吸收光譜(UV) 由圖1、2可知，保留時間為16.60 min的化合物紫外吸收峰為237、292 nm，該吸收光譜特征明顯，最強吸收峰(237 nm)的吸光強度為1.0，比弱峰(292 nm，吸光強度為0.1)高出約10倍，該特征為紫外吸收光譜的重要特征(相當于摩爾吸光系數ε)。

2.3 HBERC-31270活性產物的質譜(MS) 由圖3可知，在正離子流中m/z616.4處有1個強峰，m/z633.2處有1個次強峰，一般情況下，可能會將這2個峰之一作為分子離子峰。不過，由于MS的特征，常會出現2個分子結合在一起形成質譜峰，即產物的分子量約為該值的50%。在負離子流中，最高豐度為m/z307.1，正離子流中對應峰為m/z308.9。根據MS特征，判定該峰為產物分子離子峰，即該產物的分子量為308.00 Da。

2.4 活性化合物的快速鑒定 將化合物分子量及紫外吸收峰波長輸入Chapman化合物數據庫查詢，條件為分子量在307～309，紫外吸收峰值波長23*和 29*(*號代表任意值，考慮到不同儀器間的誤差)。查詢得到3個化合物，1個來自放線菌，另外2個來自其他植物，據此初步判斷活性產物為源于放線菌的9-甲基鏈米酮，其分子量為307.38 Da。

圖1 HBERC-31270提取物HPLC-MS圖譜Fig.1 HPLC-MS spectrum analysis of HBERC-31270 extract

圖2 活性化合物的UV圖譜Fig.2 The ultraviolet absorption spectrum of active compounds

查詢文獻[11-12]可知，9-甲基鏈米酮的摩爾吸光系數ε(λ230 nm)為23 100，ε(λ291 nm)為790，與該菌株活性產物紫外光譜相似。

確定該化合物分子式為C17H25NO4，其結構式如圖4所示。2.5 HBERC-31270室內及田間活性評價 由圖5、6可知，HBERC-31270不僅對常見農作物真菌病害如番茄灰霉病、水稻紋枯病等具有較好的抑制效果，對小麥白粉病、蠶豆銹病等也具有較好的防治效果。

3 討論

進行天然產物結構的鑒定通常需要四大光譜，即紅外光譜、紫外光譜、質譜和核磁共振譜。紅外光譜提供了化合物分子振動的信息，紫外光譜則是分子內部電子能級躍遷的

圖3 活性產物的MS圖譜(保留時間=16.60 min)Fig.3 MS of active compounds (16.60 min)

圖4 9-甲基鏈米酮的結構式Fig.4 The chemical formula of 9-methylstreptimidone

圖5 HBERC-31270室內活性評價結果Fig.5 Evaluation results of indoor activity of HBERC-31270

圖6 HBERC-31270盆栽活性評價結果Fig.6 Evaluation results of pot test of HBERC-31270

結果，質譜提供了分子離子及其碎片的信息，核磁共振譜則體現了化合物中化學鍵的關系。紅外及核磁共振譜的獲得

需要有一定量的純化合物(純度95%以上，質量2 mg以上)，并進行高分辨質譜、氫譜、碳譜分析及結構解析，這些化合物的獲得需要進行發酵、提取、精制等程序，費時費力，所以采用四大光譜進行化合物的鑒定非常耗時。一般鑒定1個未知化合物需要1至數月甚至更長時間。

在微生物源天然產物的篩選過程中，由于篩選到的絕大多數活性化合物均已知，如對每一活性化合物進行四大光譜分析，則費時費力。因此，在篩選過程中，進行化合物的快速早期鑒別，對天然產物的研究開發具有重要意義。

據文獻報道，9-甲基鏈米酮屬亞胺類天然產物，具有廣譜抗真菌活性，并有抗病毒活性，且毒性明顯低于同類天然產物放線菌酮(環己酰亞胺)。同后者相比，國內極少見相關文獻報道。由于其良好的抗真菌活性和較低的毒副作用，推測該產物具有良好的應用開發前景。參考文獻

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Rapid Identification and Activity Evaluation of a Broad Spectrum Antifungal Natural Products

WAN Zhong-yi,ZHANG Ya-ni,ZHANG Zhi-gang,WANG Kai-mei*et al

(Hubei Biopesticide Engineering Research Center/The Branch Center of Biopesticide,Hubei Agricultural Sciences and Technology Innovation Center,Wuhan,Hubei 430064)

[Objective] Rapid identification and activity evaluation were carried out for the fermentation extracts of a strain HBERC-31270 which was isolated from a soil sample collected in Xianning,Hubei province.[Method] The strain HBERC-31270 was fermented and extracted,and bio-activity determination,HPLC-MS,UV spectrum analysis and activity evaluation were carried out for the fermentation extracts.[Result] It was determined by components bioassay that the active compounds were in between 14-21 min in HPLC profile,and the compounds were identified as 9-methylstreptimidone on the basis of MS,UV absorption spectrum and natural product dictionary.It was found by pot test that the fermentation broth was very effective against a variety of fungal diseases.[Conclusion] The results provide theoretical basis for the further study of actinomycetes HBERC-31270.

Natural products; Pesticide activity; Actinomycetes; 9-methylstreptimidone

湖北省農業科技創新中心項目(2016-620-000-001-039)。

萬中義(1964- )，男，湖北天門人，研究員，博士,從事微生物天然產物研究與開發。*通訊作者，研究員，碩士，從事天然產物研究。

2016-09-21

S 482.2+92

A

0517-6611(2016)33-0009-03