膠體金免疫層析試驗檢測乙肝兩對半時HBsAg假陰性結果的處置*

王洪珍，陳小芳，錢粉紅

(1.江蘇省鎮江市第四人民醫院生殖中心 212001；2.江蘇大學附屬醫院呼吸科，江蘇鎮江 212001)

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·臨床研究·

膠體金免疫層析試驗檢測乙肝兩對半時HBsAg假陰性結果的處置*

王洪珍1，陳小芳1，錢粉紅2△

(1.江蘇省鎮江市第四人民醫院生殖中心 212001；2.江蘇大學附屬醫院呼吸科，江蘇鎮江 212001)

目的 膠體金免疫層析試驗(GICA)檢測乙肝兩對半時，對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)結果疑似假陰性的標本分別用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和時間分辨熒光分析法(TRFIA)定量試驗進行HBsAg檢測，并用抗體中和確認試驗進行確認，以獲得一個處理GICA檢測HBsAg產生假陰性結果的可靠方法。方法 2014年1月至2015年2月用GICA檢測乙肝兩對半的標本3 078例，選取其中結果為單乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)，或單乙型肝炎e抗體(抗-HBe)為陽性，或抗-HBc和抗-HBe同為陽性，而HBsAg、乙型肝炎表面抗體(抗-HBs)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)均為陰性的標本86例，分別用ELISA和TRFIA檢測其HBsAg，對檢測為陽性的標本進行抗體中和確認試驗確認。結果 86例標本經抗體中和確認試驗確認陽性的為35例；ELISA檢出陽性標本28例，其中2例為假陽性 ；TRFIA檢出陽性標本35例與抗體中和確認試驗符合率100%。結論 GICA檢測乙肝兩對半時，對HBsAg結果疑似假陰性的標本可選用TRFIA進行復查確認。

乙型肝炎表面抗原； 膠體金免疫層析試驗； 酶聯免疫吸附試驗； 時間分辨免疫熒光分析試驗； 抗體中和確認試驗

乙型肝炎(簡稱乙肝)在我國的發病率很高，乙肝表面抗原(HBsAg)是診斷HBV感染的重要標志物，HBsAg檢查對乙肝的預防和治療有重要意義[1]。目前檢測HBV標志物的方法較多，鎮江市第四人民醫院門急診患者常用膠體金免疫層析試驗(GICA)檢測乙肝兩對半，GICA 雖然方便快速，但該方法靈敏度不高，對低濃度的HBsAg會出現假陰性結果。為獲得一個處理GICA檢測HBsAg產生假陰性結果的可靠方法，本文對GICA檢測乙肝兩對半時，HBsAg結果疑似假陰性的標本分別用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和時間分辨熒光分析法(TRFIA)定量試驗進行HBsAg檢測，并用抗體中和確認試驗進行確認，現報道如下。

1 資料與方法

1．1 標本來源 2014年1月至2015年2月鎮江市第四人民醫院共有3 078例患者靜脈血清用GIA檢測乙肝兩對半，選取其中單乙肝核心抗體(抗-HBc)，或單乙肝e抗體(抗-HBe)為陽性，或抗-HBc和抗-HBe同為陽性，而HBsAg、乙肝表面抗體(抗-HBs)、乙肝e抗原(HBeAg)均為陰性的標本，其中單抗-HBc陽性標本44例，單抗-HBe陽性標本3例，抗-HBc和抗-HBe同為陽性標本39例，共計86例。

1．2 儀器與試劑 全自動時間分辨免疫熒光儀EasyCuta，BIO-RAD model 550酶標儀，洗板機。GICA乙肝兩對半測試卡為愛博生物醫藥(杭州)有限公司提供,ELISA)試劑盒由北京萬泰生物藥業股份有限公司提供,TRFIA定量檢測試劑為蘇州新波生物技術有限公司提供,HBsAg抗體中和確認試劑盒由珠海麗珠試劑股份有限公司提供。

1．3 方法 各方法嚴格按照操作說明書進行操作。GICA 在10 min和30 min各觀測一次結果,以后者報告結果，30 min后判定無效。ELISA測定時，用洗板機洗板，用酶標儀測定各A 值，按盒內說明書計算Cutoff 值；每板設空白1 孔，陰、陽性對照血清各兩孔；陰性對照孔A值≤0.10，陽性對照孔A值≥0.80，否則實驗無效；陰性對照孔A值<0.05按0.05計算。TRFIA操作前按要求做好標準曲線,并作室內質量控制。HBsAg最終結果以HBsAg抗體中和確認試驗結果為判斷標準，HBsAg抑制率≥50%為陽性。檢測流程：首先進行GICA乳膠板檢測乙肝血清學標志物，篩選其單抗-HBc，或單抗-HBe為陽性，或抗-HBc和抗-HBe同為陽性，而HBsAg、抗-HBs、HBeAg均為陰性的標本，再用ELISA和TRFIA定量試驗進行HBsAg檢測，并對檢測為陽性的標本進行HBsAg抗體中和確認試驗確認。

2 結 果

2.1 HBsAg確認試驗對ELISA和TRFIA檢測HBsAg陽性結果的確認 入選的86例標本中，GICA結果為抗-HBc和抗-HBe同為陽性標本39例，經ELISA檢測HBsAg為陽性的17例，經TRFIA檢測HBsAg為陽性的20例；GICA結果為單抗-HBc陽性標本44例，經ELISA檢測HBsAg為陽性的8例，經TRFIA檢測HBsAg為陽性的12例；GICA結果為單抗-HBe陽性標本3例，經ELISA檢測HBsAg為陽性的3例，經TRFIA檢測HBsAg為陽性的3例。ELISA檢測為陽性的合計28例占32.56%(28/86)，TRFIA檢測為陽性的合計為35例占40.70%(35/86)，兩種方法共檢測出HBsAg陽性標本37例，經HBsAg抗體中和確認試驗確認為陽性的為35例，見表1。

表1 HBsAg確認試驗對ELISA和TRFIA檢測HBsAg陽性結果的確認(n)

2.2 HBsAg TRFIA定量試驗陰性的標本進一步檢測分析結果 對51例TRFIA HBsAg定量試驗陰性標本進一步檢測分析，發現有29例抗-HBs陽性，占33.72%(29/86)。

3 討 論

GICA 檢測乙肝兩對半具有方便快速、干擾因素少，可單個標本操作等優點，能滿足急診檢驗的需要，為門診、急診患者和無償獻血現場采血前檢測乙肝標志物提供了便利條件。但是該方法靈敏度不高，HBsAg的檢測限一般為1 ng/mL，對于HBsAg弱陽性標本的檢出率不高，容易出現假陰性。本實驗結果顯示，入選的86例疑似HBsAg假陰性標本，最終確認有35例為HBsAg弱陽性，占40.70%(35/86)，對51例HBsAg陰性標本進一步檢測分析，發現還有29例抗-HBs弱陽性，占33.72%(29/86)，因此GICA檢測乙肝兩對半，只能作為篩查方法，對于疑似HBsAg假陰性標本需要用更準確的方法進行復查后方能發出報告。

ELISA靈敏度較高、特異性較好，操作方便且不需要很精貴的儀器，各診斷指標都比較理想且成本較低,基本滿足了臨床需求，是目前國內基層醫院檢測HBsAg最常用的方法。但該方法的操作步驟較多，整個實驗過程持續時間長，而且國產ELISA試劑盒的靈敏度一般在0.5 ng/mL，對HBsAg臨界標本檢測的正確率并不理想，對一些低水平的HBsAg檢出能力有限，仍有漏檢，會產生一定的假陰性。在本實驗中，最終確認的35例HBsAg弱陽性標本，ELISA僅檢出26例陽性。標本溶血、標本污染、標本放置過久、標本凝集不全、操作中的因素(孵育時間、洗板、加樣量等)都有可能造成ELISA結果為假陽性。在本實驗中，ELISA檢出的28例HBsAg弱陽性標本，有2例為假陽性。

TRFIA HBsAg定量試驗HBsAg檢測的靈敏度、特異性明顯提高，使HBsAg滴度表達很低的標本得以檢出,靈敏度一般在0.2 ng/mL，并能檢測變異的HBsAg，對臨床診斷及流行病學調查有著重要意義。全自動時間分辨免疫熒光儀EasyCuta從標本加樣到結果全部由儀器自動化完成，從而避免了人為誤差產生，做到了自動、準確、快速。有研究者提出，對于低濃度的HBsAg應引起足夠的重視[2-5]。本實驗中，HBsAg水平低的標本，GICA和ELISA靈敏度不夠而漏檢的，經TRFIA檢測后均被檢出，并經HBsAg抗體中和確認試驗最終確認，符合率100%。李金明[3]提出應重視對弱反應性標本的確認，排除假陽性，得出一個正確的結果，對患者負責。 ELISA不僅因靈敏度的原因會出現假陰性結果，且存在一定程度的假陽性，在操作中需要注意防范，對弱陽性標本也需要進一步復查確認，確保結果準確可靠。曹樹正等[6]曾以微粒子酶免發光法(MEIA)來確認ELISA檢測HBsAg產生假陰性的標本，經抗體中和確認試驗確認，MEIA也存在一定的假陽性，其低反應標本仍要經過抗體中和確認試驗來驗證。而TRFIA結果準確、靈敏度高、特異性好，對HBsAg弱陽性標本有較好的檢出率，檢測變異的HBsAg能力也強。因此，GICA對乙肝兩對半檢測時，對其中單抗-HBc陽性，或單抗-HBe為陽性，或抗-HBc和抗-HBe同為陽性，而HBsAg、抗-HBs、HBeAg均為陰性的疑似HBsAg假陰性標本可用TRFIA HBsAg定量試驗進一步檢測確認，核定結果后再發正式報告。

[1]王海剛，丁磊，潘航，等.3種HBsAg檢測方法的比較[J]．國際檢驗醫學雜志，2014,35(12):1614-1615.

[2]王蕾，劉華，王雯靜，等.低水平乙型肝炎表面抗原的檢測及其臨床價值評估[J]．微生物與感染，2009，4(1)：9-12．

[3]王文武,曹樹正，楊杰，等．對乙型肝炎表面抗原弱陽性結果進行確認試驗的應用研究[J]．檢驗醫學，2010，25(4)：301-303．

[4]李金明．感染性疾病血清學檢驗中應重視對弱反應性標本的確認[J]．中華檢驗醫學雜志，2006，29(7)：577-580．

[5]康煒，辛娜，尤濤，等．ROC曲線對ELISA檢測HBsAg陽性判斷值的確定及應用評價[J]．現代檢驗醫學雜志，2010，25(6)：49-50．

[6]曹樹正，王文武．乙型肝炎表面抗原ELISA 檢測假陰性樣本的分析[J]．現代檢驗醫學雜志，2012，27(1)：9-10．

國家自然科學基金資助項目(81370119)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.036

A

1673-4130(2016)23-3333-02

2016-06-12

2016-09-02)

△通訊作者，E-mail:zhaoqian604@126.com。