前列腺素E2誘導(dǎo)前列腺間質(zhì)細(xì)胞肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和白細(xì)胞介素-8的表達(dá)

田亞瓊，張 琚，彭雁飛，劉樹(shù)業(yè)△

(1.天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 300170；2.南開(kāi)大學(xué)生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院生物化學(xué)教研室，天津 300193)

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·論 著·

前列腺素E2誘導(dǎo)前列腺間質(zhì)細(xì)胞肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和白細(xì)胞介素-8的表達(dá)

田亞瓊1，張 琚2，彭雁飛3，劉樹(shù)業(yè)1△

(1.天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 300170；2.南開(kāi)大學(xué)生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院生物化學(xué)教研室，天津 300193)

目的 探討前列腺素E2(PGE2)在前列腺間質(zhì)活化過(guò)程中的作用。方法 體外培養(yǎng)人前列腺間質(zhì)細(xì)胞人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞(WPMY-1)，用二甲基亞砜(DMSO)和10-9mol/L前列腺素E2(PGE2)處理后進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)肌成纖維細(xì)胞表型的變化。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)細(xì)胞中炎性因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)的表達(dá)，并測(cè)定IL-8的濃度。結(jié)果 PGE2顯著增加WPMY-1細(xì)胞中α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和波形蛋白共定位的細(xì)胞比例。PGE2促進(jìn)WPMY-1細(xì)胞中IL-8的表達(dá)。結(jié)論 PGE2能增加體外培養(yǎng)的WPMY-1肌成纖維細(xì)胞表型，促進(jìn)IL-8的表達(dá)，在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。

間質(zhì)細(xì)胞活化； 熒光染色； 成纖維細(xì)胞表型

上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成活化的間質(zhì)細(xì)胞[1]，活化間質(zhì)在前列腺上皮內(nèi)瘤(PIN)組織中出現(xiàn)，表現(xiàn)出波形蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)共定位的肌成纖維細(xì)胞表型[2]。從前列腺癌組織中分離出的活化間質(zhì)細(xì)胞與良性前列腺增生的上皮細(xì)胞系BPH-1在裸鼠體內(nèi)重構(gòu)能夠誘導(dǎo)出前列腺癌，而從正常前列腺組織中分離的間質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有這個(gè)作用，表明活化的間質(zhì)細(xì)胞能促進(jìn)前列腺癌發(fā)生[3]。活化的間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲[4]，分泌CXCL12促進(jìn)血管生成和癌細(xì)胞遷移[5]，分泌白細(xì)胞介素(IL)-6促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖[6]。

與正常組織相比，前列腺癌和PIN組織中環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)升高[7]，其產(chǎn)物PGE2在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著升高[8]。PGE2能夠促進(jìn)PIN細(xì)胞和癌細(xì)胞的增殖以及血管形成[9-11]，也通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)癌細(xì)胞的遷移和侵襲[12]。研究發(fā)現(xiàn)PGE2能夠通過(guò)誘導(dǎo)前列腺間質(zhì)細(xì)胞旁分泌基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)從而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[13]，提示PGE2可能誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞活化。文獻(xiàn)報(bào)道，IL-8能夠促進(jìn)前列腺間質(zhì)細(xì)胞的活化，增加α-SMA和波形蛋白共定位的肌成纖維細(xì)胞的表型[14]。本研究檢測(cè)了PGE2對(duì)人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞(WPMY-1)中IL-8表達(dá)和肌成纖維細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)，結(jié)果表明，PGE2能夠促進(jìn)IL-8的mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PGE2能夠顯著增加共表達(dá)α-SMA和波形蛋白的細(xì)胞比例。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺間質(zhì)細(xì)胞WPMY-1 購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)。

1.2 試劑 改良杜氏伊格爾(DMEM)培養(yǎng)液，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；5%胎牛血清，購(gòu)于美國(guó)Invirogen公司；PGE2，購(gòu)于美國(guó)Cayman Chemical公司；α-SMA抗體，購(gòu)于北京博奧森公司；Vimentin，購(gòu)于武漢博士德公司；熒光二抗Alexa Fluor?488 驢抗兔IgG(H+L)及Alexa Fluor?594 驢抗小鼠IgG(H+L)，購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Promega公司；UltraSYBR Mixture，購(gòu)于北京康為世紀(jì)公司；人IL-8引物，購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，購(gòu)于武漢博士德公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀，購(gòu)于美國(guó)MJ Research公司；倒置熒光顯微鏡，購(gòu)于Nikon公司；紫外光可見(jiàn)光分光光度計(jì)，購(gòu)于Pharmacia公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺間質(zhì)細(xì)胞WPMY-1使用含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 免疫熒光染色將體外培養(yǎng)的WPMY-1細(xì)胞種植在直徑為1.5 cm的圓玻璃片上，細(xì)胞貼壁后，換成含有1%活性炭處理血清繼續(xù)培養(yǎng)36 h，分別使用DMSO和10-9mol/L PGE2處理細(xì)胞96 h。預(yù)冷的丙酮固定細(xì)胞后使用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，再用含有10%胎牛血清的PBS封閉。α-SMA抗體和Vimentin用來(lái)孵育細(xì)胞玻片，熒光二抗為Alexa Fluor?488驢抗兔IgG(H+L)及Alexa Fluor?594驢抗小鼠IgG(H+L)。

1.4.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中IL-8的表達(dá)將體外培養(yǎng)的WPMY-1種植在6孔板中，細(xì)胞貼壁后，換成含有1%活性炭處理血清繼續(xù)培養(yǎng)36 h，分別使用二甲基亞砜(DMSO)和10-9mol/L PGE2處理細(xì)胞24 h。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)。人IL-8引物上游序列：5′-CTC TGG CAG CCT TCC TGA TT-3′;下游序列:5′-TAT GCA CTG ACA TCT AAG TTC TTT AGC-3′。

1.4.4 條件培養(yǎng)液中IL-8濃度的測(cè)定將體外培養(yǎng)的WPMY-1種植在6孔板中，細(xì)胞貼壁后，換成含有1%活性炭處理血清繼續(xù)培養(yǎng)36 h，分別使用DMSO和10-9mol/L PGE2處理細(xì)胞48 h。收集各孔細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，并對(duì)每孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。檢測(cè)條件培養(yǎng)液中IL-8的濃度，并根據(jù)細(xì)胞數(shù)計(jì)算同等細(xì)胞數(shù)IL-8 分泌的差別。

2 結(jié) 果

2.1 PGE2增加體外培養(yǎng)的WPMY-1肌成纖維細(xì)胞表型 體外培養(yǎng)的WPMY-1,分別種植在6張圓玻璃片上,1%活性炭血清處理36 h后，分別用DMSO和10-9mol/L PGE2處理WPMY-196 h，通過(guò)α-SMA(綠色熒光)和Vimentin(紅色熒光)的表達(dá)檢測(cè)細(xì)胞表型的變化，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每張圓片隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照分析。結(jié)果表明，PGE2顯著增加WPMY-1中α-SMA和Vimentin共定位的細(xì)胞比例。

2.2 PGE2促進(jìn)WPMY-1細(xì)胞中IL-8的表達(dá) 將體外培養(yǎng)的WPMY-1細(xì)胞分別種植在兩個(gè)6孔板中，1%活性炭血清培養(yǎng)36 h后，每板中3個(gè)孔作為對(duì)照組，3個(gè)孔用10-9mol/L PGE2處理，24 h后提取總RNA，在48 h后收集兩組細(xì)胞的條件培養(yǎng)液并細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中IL-8 mRNA相對(duì)持家基因HpRT的表達(dá)量，用2-ΔΔCT方法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明PGE2能夠上調(diào)WPMY-1細(xì)胞中IL-8的表達(dá)。同時(shí)，ELISA分析顯示PGE2處理的WPMY-1細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中IL-8蛋白的濃度顯著高于DMSO處理組。見(jiàn)圖1。

注：A為PGE2處理WPMY-1細(xì)胞24 h后；B為PGE2處理WPMY-1細(xì)胞48 h后。與對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

圖1 WPMY-1細(xì)胞中IL-8 mRNA的表達(dá)和IL-8蛋白的濃度

3 討 論

腫瘤微環(huán)境是近十年來(lái)發(fā)展最快的研究領(lǐng)域之一，越來(lái)越多的證據(jù)表明前列腺癌的發(fā)展很大程度上依賴于其所處的微環(huán)境。前列腺間質(zhì)細(xì)胞在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中轉(zhuǎn)變?yōu)轭?lèi)似于損傷修復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)的肌成纖維細(xì)胞表型，因此也有學(xué)者將癌癥稱為永不愈合的損傷。癌間質(zhì)中的肌成纖維細(xì)胞也被稱為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)，通過(guò)旁分泌細(xì)胞因子和炎癥因子構(gòu)建適合癌細(xì)胞生長(zhǎng)和有利于免疫逃逸的微環(huán)境，因此可作為癌癥治療中的有效靶標(biāo)。活化間質(zhì)細(xì)胞的確切來(lái)源目前還不是十分清楚，其主要來(lái)源被認(rèn)為是由病灶周?chē)５某衫w維細(xì)胞通過(guò)間質(zhì)-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(MMT)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑〕衫w維細(xì)胞表型的活化間質(zhì)細(xì)胞[15]。間質(zhì)細(xì)胞活化的機(jī)制還不完全清楚，文獻(xiàn)表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、IL-6和IL-8是介導(dǎo)前列腺間質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵因子[14,16-17]。

PGE2是COX-2催化花生四烯酸產(chǎn)生的一種重要物質(zhì)，能夠通過(guò)與細(xì)胞膜受體的結(jié)合激活下游信號(hào)通路，引起細(xì)胞生理改變，COX-2/PGE2信號(hào)通路在介導(dǎo)炎性反應(yīng)和癌癥進(jìn)程中起到關(guān)鍵作用。然而，COX-2/PGE2信號(hào)通路與CAF的關(guān)系仍不清楚，研究表明，PGE2能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的前列腺間質(zhì)細(xì)胞WPMY-1中IL-8的表達(dá)，并且能夠誘導(dǎo)WPMY-1細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞。這一結(jié)果表明，前列腺癌中高表達(dá)的COX-2，可以通過(guò)局部PGE2濃度的升高誘導(dǎo)前列腺間質(zhì)細(xì)胞的活化，并且IL-8可能參與介導(dǎo)了這一過(guò)程。

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Prostaglandin E2 induced myofibrolast phenotype inversion and interleukin 8 expression in prostate stromal cells

TIANYaqiong1,ZHANGJu2,PENGYanfei3,LIUShuye1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinMunicipalThirdCentralHospital,Tianjin300170,China;2.KeyLaboratoryofBioactiveMaterialsofEducationMinistry,NankaiUniversity,Tianjin300071,China;3.TeachingandResearchSectionofBiochemistry,ChineseandWesternMedicineInstituteTianjinChineseMedicineUniversity,Tianjin300193,China)

Objective To investigate the effects of prostaglandin E2(PGE2) in prostate mesenchymal cell activation.Methods To culture human prostate stromal cells WPMY-1 in vitro,implement immunofluorescence staining after treating with DMSO and 10-9mol/L PGE2 and detect the change of the myofibroblast phenotype.The expression of cellular inflammatory factor interleukin 8(IL-8) was detected by real-time quantitative PCR and the concentration of IL-8 was detected.Results PGE2 significantly increased the cellular proportion of colocalization with alpha SMA and Vimentin in WPMY-1 cells.PGE2 promoted the expression of IL-8 in WPMY-1 cells.Conclusion PGE2 can increase myofibroblast phenotype in human prostate mesenchymal cells WPMY-1 in vitro culture,promotes the IL-8 expression,which has an important role in the occurrence and development of prostate cancer.

mesenchymal cell activation; immunofluorescence staining; myofibroblast phenotype

田亞瓊，女，技師，主要從事代謝組學(xué)以及分子生物學(xué)的研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.023

A

1673-4130(2016)23-3300-03

2016-04-28

2016-07-12)