乙型肝炎病毒外膜大蛋白意義分析及與慢性乙型肝炎患者病毒復(fù)制的相關(guān)性研究*

尹凌凡,唐景云,張日妹,冉 云，熊建輝

(1.廣東省深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科 518172；2.廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 518172；3.廣東省深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院肝病科 518172 )

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·論 著·

乙型肝炎病毒外膜大蛋白意義分析及與慢性乙型肝炎患者病毒復(fù)制的相關(guān)性研究*

尹凌凡1,唐景云2,張日妹1,冉 云3，熊建輝1

(1.廣東省深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科 518172；2.廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 518172；3.廣東省深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院肝病科 518172 )

目的 通過分析乙型肝炎病毒(HBV)感染患者血清免疫學(xué)標(biāo)志物乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)、HBV-DNA及乙型肝炎病毒標(biāo)志物(HBV-M)的相關(guān)性,探討HBV-LP對反映體內(nèi)HBV復(fù)制的意義。 方法 選取2013年4月至2015年9月深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院收治的慢性乙型肝炎感染患者540例，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測患者的血清HBV-DNA，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定HBV-LP及HBV-M,對HBV-LP、HBV-M及HBV-DNA之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果 乙型肝炎E抗原(HBeAg)陽性患者的HBV-LP陽性率為96.39%，而HBV-DNA的陽性率為93.33%，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HBV-LP水平與HBV-DNA的拷貝數(shù)對數(shù)值呈正相關(guān)；而 HBeAg陰性患者的HBV-LP陽性率為63.33%，HBV-DNA的陽性率為51.11%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 HBV外膜大蛋白能夠有效反映慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBV復(fù)制情況，其靈敏度高于HBeAg，對于HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者而言，HBV-LP更能反映患者體內(nèi)病毒的復(fù)制狀態(tài)。

乙型肝炎病毒外膜大蛋白； 慢性乙型肝炎； 乙型肝炎E抗原； 相關(guān)性

慢性乙型肝炎是指由乙型肝炎病毒(HBV)引起的傳染病。慢性乙型肝炎屬于世界流行性疾病，報(bào)道稱全球約有3.5億人為HBV的攜帶者，而我國為HBV感染的高發(fā)國家[1]。近年來，隨著乙型肝炎疫苗的普遍接種，HBV感染控制較為理想，但是關(guān)于抗HBV治療效果的監(jiān)測，包括體內(nèi)病毒水平及復(fù)制情況，仍然是臨床工作者較為關(guān)注的問題。 乙型肝炎E抗原(HBeAg)和HBV-DNA 是目前臨床上用于評價(jià)患者體內(nèi)HBV復(fù)制情況的有效指標(biāo)，但是HBeAg陰性的乙型肝炎患者其體內(nèi)仍可能存在病毒復(fù)制，并且HBV-DNA的檢測費(fèi)用和檢測要求也在一定程度上限制了HBV-DNA的檢測[2-3]。研究顯示，乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)與HBV復(fù)制密切相關(guān),能有效反映患者體內(nèi)HBV的復(fù)制情況[4]。本研究中，選取540例慢性乙型肝炎患者就HBV-LP與HBV復(fù)制的相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年4月至2015年9月深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院收治的慢性乙型肝炎患者540例，其中男340例、女200例，年齡20～70歲、平均(43.8±4.2)歲；所選患者均符合2005年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會與感染病學(xué)分會聯(lián)合制定的關(guān)于HBV感染的診治標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除乙型肝炎以外的其他類型肝炎、結(jié)核病、肝硬化、糖尿病及神經(jīng)精神疾病等。

1.2 方法 患者空腹?fàn)顟B(tài)下采取血液標(biāo)本，分離血清后凍存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎脤?shí)時(shí)熒光定量PCR檢測患者的血清HBV-DNA，熒光定量PCR 儀購自羅氏，試劑盒購自湖南圣湘科技有限公司，<5×102copy/mL為HBV-DNA陰性；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定HBV-LP及乙型肝炎病毒標(biāo)志物(HBV-M)[乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(抗-HBS)、HBeAg、乙型肝炎e抗體(抗-HBe)和乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)]。全自動酶標(biāo)儀購自鄭州安圖生物工程有限公司；試劑盒購自深圳百安生化技術(shù)有限公司。所有指標(biāo)的檢測方法均按照說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 HBeAg陰性和HBeAg陽性患者HBV-LP和HBV-DNA陽性率之間的比較 540例慢性乙型肝炎患者中HBeAg陰性患者180例(33.33%)和HBeAg陽性患者360例(66.67%)；在HBeAg陽性患者中，HBV-LP與HBV-DNA的陽性率分別為96.39%和93.33%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在HBeAg陰性患者中，HBV-LP與HBV-DNA的陽性率分別為63.33%、51.11%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。540例慢性乙型肝炎患者血清中不同的HBV標(biāo)志物模式中，HBV-DNA和HBV-LP在 HBeAg陰性和 HBeAg陽性的檢出率不同，在 HBsAg(+)HBeAg(+)抗-HBc(+)、HBsAg(+) 抗-HBe(+)抗-HBc(+)以及HBsAg(+) 抗-HBc(+)這3種模式中，HBV-DNA和HBV-LP在 HBeAg陰性患者中的檢出率較低。見表2。

表1 HBeAg(-)和HBeAg(+)患者HBV-LP和HBV-DNA陽性率之間的比較[n(%)]

表2 不同HBV-M模式下HBV-LP和HBV-DNA陽性率比較[n(%)]

續(xù)表2 不同HBV-M模式下HBV-LP和HBV-DNA陽性率比較[n(%)]

2.2 血清HBV-LP與HBV-DNA的關(guān)系 在428例HBV-DNA陽性的血清標(biāo)本中，HBV-LP OD值與HBV-DNA拷貝數(shù)對數(shù)值呈良好的正相關(guān)(回歸方程為Y=0.258X-0.845,回歸系數(shù)r=0.984,P<0.01)，隨著HBV-DNA拷貝數(shù)的增加，HBV-LP OD值也呈上升趨勢。見表3。

表3 血清HBV-LP與HBV-DNA的關(guān)系

3 討 論

慢性乙型肝炎是我國常見的慢性傳染病之一，流行病學(xué)資料表明我國每年死于HBV相關(guān)性疾病的患者多達(dá)35萬，HBV嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[6]。因此，建立一種簡單、靈敏度高且重復(fù)性好的HBV檢測方法具有重要的臨床意義。目前，臨床上反映慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBV復(fù)制情況的指標(biāo)主要包括HBV-DNA和HBeAg兩種[7]。通常采用定量PCR檢測HBV-DNA，但是由于該方法對實(shí)驗(yàn)條件有較高要求，因而很多基層醫(yī)療單位無法開展而導(dǎo)致其應(yīng)用受限。研究表明慢性乙型肝炎患者的HBeAg轉(zhuǎn)陰并不代表HBV復(fù)制的停止，事實(shí)上當(dāng)HPV前C或 BCP區(qū)發(fā)生變異后會導(dǎo)致 HBeAg 合成障礙，表現(xiàn)出HBeAg陰性但病毒復(fù)制未受影響的情況，這說明HBeAg 陰性并不能表示HBV復(fù)制的終止，因此尋找新的能夠有效代表HBV復(fù)制的免疫血清學(xué)指標(biāo)是目前臨床研究的熱點(diǎn)之一[8-9]。

HBV-LP是HBV上與肝細(xì)胞膜特異性受體結(jié)合的主要蛋白成分之一，HBV-LP主要由 HBsAg、前S1蛋白(pre-S1)和前S2蛋白(pre-S2)組成[10]。研究表明，HBV-LP與HBV的復(fù)制程度密切相關(guān)，在感染早期，HBV-LP通過與細(xì)胞受體結(jié)合而介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在感染晚期，HBV-LP在主蛋白(HBsAg)和中蛋白( HBsAg、前S2蛋白) 的作用下組裝并分泌出完整病毒外殼[11]。近年來，隨著國內(nèi)外對HBV外膜蛋白在乙型肝炎發(fā)病、感染與病毒復(fù)制等方面的深入研究，HBV-LP已逐漸成為研究熱點(diǎn)[12]。HBV-LP具有雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，通過激活蛋白激酶 C而導(dǎo)致 C-RAF/ERK2信號級聯(lián)放大通路的激活，從而控制細(xì)胞因子和病毒啟動子的表達(dá)。此外，研究發(fā)現(xiàn)HBV-LP具有肝細(xì)胞毒性且對HBV的復(fù)制具有反式激活作用[3]。 趙燕飛等[13]的研究結(jié)果顯示，HBV感染患者的血清HBV-LP可以有效地反映患者體內(nèi)的病毒復(fù)制情況，其水平與HBV-DNA的拷貝數(shù)明顯相關(guān),可以作為抗病毒治療的新型血清免疫學(xué)指標(biāo)之一,尤其是對于 HBeAg 陰性的HBV感染患者而言，HBV-LP具有重要的臨床診斷價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，360例HBeAg陽性的HBV感染患者中，HBV-LP的陽性檢出率與HBV-DNA的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在180例HBeAg陰性的HBV感染患者中，HBV-LP的陽性檢出率明顯高于HBV-DNA的陽性率，這種差異可能是由于HBV-LP和HBV-DNA的檢測方法不同所致，同樣也提示相對于HBV-DNA，HBV-LP更能反映HBeAg陰性患者體內(nèi)的HBV復(fù)制情況。此外，還發(fā)現(xiàn)在428例HBV-DNA陽性的血清標(biāo)本中HBV-LP OD值與HBV-DNA拷貝數(shù)對數(shù)值呈良好的正相關(guān)，隨著HBV-DNA拷貝數(shù)的增加，HBV-LP OD值也呈上升趨勢。說明HBV-LP可以作為HBV感染、診斷、治療及預(yù)后的參考指標(biāo)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，與趙燕飛等[13]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，HBV外膜大蛋白能夠有效反映慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBV復(fù)制情況，其靈敏度高于HBeAg，對于HBeAg陰性的慢性乙型肝炎患者而言，HBV-LP更能反映患者體內(nèi)病毒的復(fù)制狀態(tài)。

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Analysis on significance of HBV envelope large protein and its correlation with virus replication in patients with chronic hepatitis B*

YINLingfan1,TANGJingyun2,ZHANGRimei1,RANYun3，XIONGJianhui1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,LonggangDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine,Shenzhen,Guangdong518172,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,PingshanNewDistrictPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518172,China;3.DepartmentofLiverDiseases,LonggangDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine,Shenzhen,Guangdong518172,China)

Objective To analyze the relationship among serum hepatitis B virus(HBV) envelope large protein(HBV-LP),HBV-DNA and HBV marker(HBV-M) for investigating the clinical significance of HBV-LP to reflect the HBV in vivo replication in the patients with HBV infection.Methods Total 540 cases of chronic HBV infection treated in the Longgang District Hospital of Traditional Chinese Medicine from April 2013 to September 2015 were selected.The real-time fluorescence quantitative PCR method was used to detect serum HBV-DNA,HBV-LP and HBV-M were detected by the enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).The correlation among HBV-LP,HBV-M and HBV-DNA were analyzed.Results The positive rate of HBV-LP in HBeAg-positive patients was 96.39%,and which of HBV-DNA was 93.33%,there was no statistically significant difference between them(P>0.05);The serum HBV-LP level was positively related with the logarithmic value of HBV-DNA copies;the positive rate of HBV-LP in HBeAg-negative patients was 63.33%,and which of HBV-DNA was 51.11%,the difference between them was statistically significant(P<0.05).Conclusion HBV-LP can effectively reflect the HBV in vivo replication in the patients with chronic hepatitis B and its sensitivity is higher than that of HBeAg,HBV-LP can even more reflect the HBV in vivo replication status in patients with HBeAg-negative chronic hepatitis B.

hepatitis B virus envelope large protein; chronic hepatitis B; hepatitis B virus E antigen; correlation

廣東省深圳市坪山新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)科研資助項(xiàng)目(201428)。

尹凌凡，女，副主任技師，主要從事細(xì)胞免疫研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.012

A

1673-4130(2016)23-3271-03

2016-04-26

2016-07-18)