慢性粒細胞白血病患者骨髓部分細胞因子的表達及意義*

宋建新，張 芹，梅 芬，歐陽紅梅，蔣雅先，撒亞蓮△

(云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院:1.血液病診斷室;2.臨床基礎研究所，昆明 650032)

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·論 著·

慢性粒細胞白血病患者骨髓部分細胞因子的表達及意義*

宋建新1，張 芹1，梅 芬2，歐陽紅梅1，蔣雅先1，撒亞蓮2△

(云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院:1.血液病診斷室;2.臨床基礎研究所，昆明 650032)

目的 探討慢性粒細胞白血病(CML)患者不同時期骨髓白細胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及干擾素-γ(INF-γ)表達的變化。方法 應用流式細胞儀分析30例CML慢性期(CML-CP)、21例加速期(CML-AP)、15例急變期(CML-BP)，經治療后緩解患者42例、未緩解患者7例的骨髓液中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及INF-γ表達水平,并與對照組比較。結果 CML各組患者INF-γ、IL-2水平均低于對照組(P<0.05)，IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10均高于對照組(P<0.05)。隨著病情進展，INF-γ、IL-2水平逐漸降低,即CML-BPCML-AP>CML-CP，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。患者經治療完全緩解后，INF-γ、IL-2有所回升，但仍低于對照組(P<0.01)，IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10有所降低，同樣也高于CML-CP(P<0.05)；未緩解組IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10及IL-2、INF-γ與急變期相比差異無統計學意義(P>0.05)。結論 在CML患者骨髓微環境中細胞因子水平的變化對CML的發生、發展及與預后評估有一定的意義；檢測CML骨髓IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10及INF-γ水平有望為CML患者免疫治療及預后判斷提供新的思路和理論依據。

慢性粒細胞白血病； 白細胞介素; 干擾素-γ

慢性粒細胞白血病(CML)是起源于多能造血干細胞的惡性克隆性增殖性疾病，根據臨床病程可分為慢性期(CP)、加速期(AP)和急變期(BP)。骨髓微環境是由基質細胞、輔助細胞(T淋巴細胞和單核/巨噬細胞)、細胞外基質和細胞因子組成的一個有序的復雜結構，其不僅提供造血細胞賴以生存、發育及分化的場所，同時其改變也為血液系統惡性腫瘤提供了一個合適的生存空間。細胞因子作為骨髓微環境的重要成分，在維持骨髓微環境的動態平衡中起著重要作用。為切實反映骨髓微環境中細胞因子的變化對CML腫瘤細胞的影響，本文通過對CML不同時期治療前后骨髓液中細胞因子水平的檢測，探討CML患者骨髓免疫微環境部分細胞因子改變在CML發病和化療過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 66例患者均來自云南省第一人民醫院血液科門診及住院患者，經骨髓細胞形態、細胞遺傳學及分子生物學檢查，符合CML各期的診斷標準[1]。其中，CML-CP 30例，CML-AP 21例，CML-BP 15例，男42例、女24例，年齡18～78歲、中位年齡56歲；經治療后完全緩解44例，未緩解7例，其中CML-CP除8例失訪全部完全緩解，21例CML-AP患者中完全緩解14例、未緩解3例、4例轉外院治療而失訪，CML-BP完全緩解8例、未緩解4例、治療中1例死亡、2例轉外院失訪。30例缺鐵性貧血患者作為對照組，其中男18例，女12例；年齡18～76歲，中位年齡54.5歲。本研究獲醫院倫理委員會批準，并征得所有受試者知情同意。

1.2 試劑與儀器 白細胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、干擾素-γ(IFN-γ)試劑盒購自BD公司。流式細胞儀為Beckman Coulter公司FC500。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 采集CML患者治療前后及初診缺鐵性貧血患者骨髓液2.0 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，3 000 r/min離心30 min，取上清液-80 ℃保存待測。

1.3.2 細胞因子檢測 按照試劑盒說明書設計流式細胞術方案，繪制標準曲線。計算所需微球量，混合微球，以1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入丟棄上清液相同量的增強劑混合待用。取試管編號，每管加入20 μL離心后的骨髓上清液，每管加入混合微球50 μL及PE染料50 μL，避光孵育3 h，加入wash buffer液600 mL混勻，1 500 r/min離心10 min棄上清液，加入300 μL wash buffer液混勻上機檢測，用FCAP分析軟件分析。

2 結 果

與對照組相比，CML-CP患者骨髓微環境中INF-γ、IL-2水平明顯降低(t=7.45,10.69,P<0.05)，IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平明顯增高(t=17.58,11.08，13.08,11.30,P<0.05)；INF-γ、IL-2在CML-BP明顯低于CML-AP(t=8.05,8.40，P<0.05),CML-AP明顯低于CML-CP(t=6.44,6.61,P<0.05)；IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10在CML-BP明顯高于CML-AP(t=9.78,6.89，9.10,9.74,P<0.05),CML-AP明顯高于CML-CP(t=15.64,11.84，9.61,11.69,P<0.01)；INF-γ在緩解組與CML-CP比較差異無統計學意義(t=1.21，P>0.05)，IL-2在緩解組高于CML-CP(t=2.97，P<0.05)，但仍低于對照組(P<0.05)；緩解組IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10與CML-CP比較有所降低，但差異有統計學意義(t=11.90，7.08，11.04，6.18，P<0.05)。未緩解組INF-γ、IL-2、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平與CML-BP組相比差異無統計學意義(t=0.46，0.90，0.09，0.57，0.10，2.20，P>0.05)。見表1。

表1 各組IL-1β、IL-2、IL-4 、IL-6、IL-10及INF-γ水平檢測結果

3 討 論

CML是獲得性造血干細胞惡性克隆性疾病，其典型特征是Ph陽性并表達具有強酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白。CML患者應用ABL酪氨酸激酶抑制劑(TKI)疾病很容易得到控制，但經治療達完全細胞遺傳學緩解的CML患者體內仍殘留有107個左右包括白血病干細胞(LSC)的白血病細胞，這些微小殘留LSC是CML不能被最終治愈和復發的根本原因,這可能與BCR/ABL基因突變及相關耐藥性有關[2]。正常情況下，造血微環境中具有調控活性的基質細胞等通過合成和釋放造血因子和造血抑制因子來調控血細胞的生長，并維持血細胞在不同階段的正常形態。細胞因子作為骨髓微環境的重要組成成分，在許多腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。因此，了解CML骨髓微環境細胞因子的變化，進一步確定有效的治療尤為重要。

IL-1β是一個多功能炎性細胞因子，主要由受到刺激的白細胞產生，在機體免疫應答、炎性反應、造血調控和腫瘤免疫中起重要作用[3]。有文獻報道，在急性白血病(AL)患者血清中IL-1β水平明顯增高，且與AML患者病情進展及預后密切相關[4-5]；研究還發現，在無外來刺激的情況下，包括CML在內的LSC及其骨髓基質細胞均可通過自分泌、旁分泌途徑產生大量IL-1β[6]。研究還顯示，IL-1β可促進惡性細胞的生長、遺傳的不穩定性及惡性細胞的克隆演變[7]。

IL-2、INF-γ屬于Th1細胞因子,它們都具有誘導Th1細胞分化，介導激活CD8+CTL細胞，產生致炎性細胞因子，增強自然殺傷(NK)細胞活性，從而發揮抗細菌、抗病毒和抗腫瘤的作用。文獻報道，Th1型細胞因子如INF-γ可將巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞，參與Th1型免疫應答，作為誘導細胞和殺傷細胞的M1型巨噬細胞參與殺傷病原體和腫瘤細胞[8]。在對AL的研究中發現，AL患者血清中IL-2、INF-γ水平明顯減低，且與AL患者病情進展及預后呈負相關[9-11]。

IL-4、IL-6、IL-10屬于Th2型細胞因子，具有介導體液免疫應答，與抑制自身免疫有關。Th2型細胞因子如IL-4、IL-10 能把巨噬細胞極化為M2型即腫瘤相關巨噬細胞(TAM)，主要參與Th2免疫調控，抑制免疫，對細胞內病原體和腫瘤細胞的殺傷能力下降，有利于腫瘤細胞的生長[7]。另有文獻報道，TAM可以釋放G0S2(G0/G1switch gene2)，加快細胞生長周期，對腫瘤細胞的增殖有很強的促進作用[12]。IL-4、IL-6、IL-10在AL中的作用已有了相關報道[8-10]，Ⅰ期在AL患者血清中水平明顯增高，其增高與AL患者病情進展及預后呈正相關。

本研究通過流式細胞儀檢測初診CML不同時期、治療后完全緩解和未緩解患者骨髓IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、INF-γ檢測發現，在CML-CP IL-2、INF-γ表達水平明顯低于對照組，隨著病情的進展逐漸降低，CML-BPCML-AP>CML-CP，且組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。提示CML患者的骨髓造血微環境發生了異常變化，即在CML骨髓微環境中Th1/Th2平衡向Th2漂移，抑制了局部細胞免疫功能，進而使機體的整個免疫系統紊亂，導致對白血病細胞的免疫耐受，且機體細胞免疫功能隨著病情的不斷加重更進一步紊亂，以致惡性克隆沖破了機體的免疫監視，從而在免疫應答誘導和效應的多個環節上抑制機體抗腫瘤免疫應答，進而導致CML的病情進展。經治療完全緩解后，IL-2、INF-γ表達水平較有所增高，但INF-γ在緩解組與CML-CP比較差異無統計學意義(P>0.05)，IL-2在緩解組高于CML-CP(P<0.05)，但仍低于對照組(P<0.05)；IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10表達水平有所降低，但仍高于CML-CP(P<0.05)。說明CML經治療后雖達到了形態學及基因水平的緩解，但免疫功能仍未恢復正常，還存在復發的因素。所以，在CML緩解后，如何恢復患者機體乃至骨髓微環境的免疫平衡，可能是最終清除白血病微小殘留的途徑之一。至于在CML患者骨髓微環境中，是否存在由細胞因子對巨噬細胞的極化，且巨噬細胞在CML中的作用及這些因子與白血病細胞之間如何相互作用還有待進一步研究。

總之，通過對CML患者骨髓部分細胞因子的研究發現，在CML患者骨髓微環境中細胞因子水平的變化對CML的發生、發展及與預后評估有一定的意義。檢測CML患者骨髓IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10及INF-γ水平有望為CML患者免疫治療及預后判斷提供新的思路和理論依據。

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Expression of partial cytokines in bone marrow of chronic myeloid leukemia patients and its significance*

SONGJianxin1,ZHANGQin1,MEIFen2,OUYANGHongmei1,JIANGYaxian1,SAYalian2△

(1.DiagnosticRoomofHematologicalDiseases;2.ResearchInstituteofClinicalBasis,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital/AffiliatedHospitalofKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To investigate the changes of IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-10 and INF-γ expressions in bone marrow of chronic myeloid leukemia(CML)patients.Methods The IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-10 and INF-γ expression levels were detected by using flow cytometry in 30 cases of CML chronic phase(CML-CP),21 cases of CML accelerated phase(CML-AP),15 cases of CML blastic phase(CML-BP),42 cases of CML remission after treatment and 7 cases of non-remission.Then the detection results were compared with those in the control group.Results The expression levels of INF-γ and IL-2 in each CML groups were lower than those in the control group(P<0.05),while the expression levels of IL-1β,IL-4,IL-6 and IL-10 were higher than those in the control group(P<0.05).With the disease condition progression,the INF-γ and IL-2 levels were gradually decreased,i.e.,CML-BPCML-AP>CML-CP,the difference among groups had statistical significance(P<0.05).After complete remission by treatment,the INF-γ and IL-2 levels were risen to some extent,but which were still lower than those in the control group(P<0.01),the expression levels of IL-1β,IL-4,IL-6 and IL-10 were decreased to some extent,but likewise were higher than those in CML-CP(P<0.05); the levels of IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10,IL-2 and INF-γ had no statistical difference between the non-remission group and CML-BP group(P>0.05).Conclusion The changes of serum cytokines in bone marrow microenvironment of CMLpatients have certain significance to the occurrence,development and prognosis of CML; the detection of IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-10 and INF-γ levels in bone marrow is hopeful to provide new ideas and theoretical basis for immune therapy and prognosis judgment of CML patients.

chronic myeloid leukemia; cytokines; interferon-γ

云南省科技廳-昆明醫科大學聯合專項應用基礎研究項目資助(2014FZ070)。

宋建新，男，副主任醫師，主要從事血液病診斷研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.006

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1673-4130(2016)23-3255-03

2016-03-05

2016-05-23)