HPLC法測(cè)定延續(xù)接骨丸中芍藥苷的含量

孫承浩+譚無名

[摘要] 目的 應(yīng)用HPLC法測(cè)定延續(xù)接骨丸中芍藥苷的含量。 方法 采用高效液相色譜法測(cè)定延續(xù)接骨丸中芍藥苷的含量。采用色譜柱：Agilent TC-C18（2）5 μm，250×4.6 mm，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)樣量為5 μL。 結(jié)果 芍藥苷在0.02514～1.0056 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.9997）；平均加樣回收率97.43%（RSD=0.79%）。 結(jié)論 應(yīng)用HPLC法測(cè)定延續(xù)接骨丸中芍藥苷的含量操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

[關(guān)鍵詞] 延續(xù)接骨丸；牛黃；赤芍；芍藥苷；HPLC

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）27-0115-03

延續(xù)接骨丸為我市中醫(yī)院生產(chǎn)的醫(yī)院制劑，由當(dāng)歸、紅花、川芎、延胡索、赤芍、乳香等15味中藥材經(jīng)干燥，粉碎，過篩，混合，每100 g粉末加煉蜜80 g制成大蜜丸，具有活血散瘀，消腫止痛的作用，主要用于治療跌打損傷，青紫腫痛，閃腰岔氣，筋斷骨折，瘀血作痛。由于原來的醫(yī)院制劑標(biāo)準(zhǔn)中沒有含量測(cè)定項(xiàng)，本文參照《中國(guó)藥典》2015年版一部、四部，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[1-6]，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）定量檢測(cè)處方中赤芍的芍藥苷含量，專屬性強(qiáng)，精密度和重復(fù)性良好。采用該方法可進(jìn)一步控制生產(chǎn)中赤芍投料，為延續(xù)接骨丸質(zhì)量監(jiān)管提供有力的參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津2010 CH-T型高效液相色譜儀（包括自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、四元低壓泵、紫外檢測(cè)器等重要組成部分）；BP211-D電子天平。LabAlliance HS3120 超聲清洗器。

1.2 試劑

乙腈為色譜純，乙醇、磷酸為分析純，芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736-201640，含量為95.2%）由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。延續(xù)接骨丸樣品由遼陽(yáng)市中醫(yī)藥制劑室提供，批號(hào)分別為160324、160420、160526。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜操作條件及系統(tǒng)適用性

采用色譜柱：Agilent TC-C18（2） 5 μm，250×4.6 mm，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），流速1.0 mL/min，波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)樣量 5 μL，柱溫30℃；

2.2 溶液的制備

（1）樣品溶液配制：取樣品適量，剪碎，混勻，取樣品約3 g，精密稱量置于錐形瓶中，加入稀乙醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，將上述混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液（圖1）。（2）對(duì)照品溶液配制：取芍藥苷對(duì)照品約20 mg精密稱定，至100 mL容量瓶中，加稀乙醇適量溶解，取5 mL上述溶液至20 mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度即得（圖2）。（3）陰性樣品溶液的制備 按工藝方法制備缺少赤芍的陰性樣品，并根據(jù)“（1）”方法制備（圖3）。

2.3 線性關(guān)系考察

精密稱取芍藥苷對(duì)照品25.14 mg置于50 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1、0.2、0.5、1、2、4 mL，分別置于10 mL量瓶中，加稀乙醇或甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。回歸方程為：Y=12063.5X-19118，r=0.9997（n=6），表明芍藥苷在0.02514～1.0056 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

取50.28 μg/mL芍藥苷對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量為5 μL，連續(xù)測(cè)定5次，以峰面積計(jì)算，RSD為0.8%，說明儀器精密度良好[5，7-10]。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

見表1。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品測(cè)定項(xiàng)下的供試品溶液在常溫條件下放置0、2、4、6 h后分別進(jìn)樣測(cè)試，記錄色譜圖，按峰面積計(jì)算，RSD為0.81%，結(jié)果表明供試品在常溫條件下6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表2。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量（0.854 mg/g）的樣品6份，精密稱定，然后分別精密加入0.2618 mg/mL的對(duì)照品溶液5、10、15 mL，再分別精密加入稀乙醇45、40、35 mL，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 KHz）30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照樣品測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，見表3。

2.8耐用性試驗(yàn)

分別采用3根不同商品規(guī)格的色譜柱，對(duì)同一批樣品按供試品溶液制備方法制備并且依給定測(cè)定條件測(cè)定含量。見表4。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本試驗(yàn)分別對(duì)提取條件進(jìn)行了下述研究：采用加熱回流、超聲波提取等方法對(duì)提取效率進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取法效率較高；提取溶劑考察了甲醇、稀乙醇溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取效果無明顯差異；考慮到試劑毒性問題，故選用稀乙醇作為提取溶劑；同時(shí)又對(duì)稀乙醇用量25 mL、50 mL、100 mL以及提取時(shí)間15 min、30 min、60 min進(jìn)行了考察，最終采用稀乙醇溶液50 mL，超聲提取30 min作為提取條件。

3.2流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相考察了乙腈-水，乙腈-磷酸溶液兩種系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸溶液系統(tǒng)分離較好，同時(shí)考察了磷酸的濃度0.05%、0.1%、0.2%對(duì)芍藥苷分離效果的影響，綜合考慮分離度及對(duì)液相色譜儀的保護(hù)，確定了正文中流動(dòng)相條件。

綜上，采用HPLC法測(cè)定延續(xù)接骨丸中芍藥苷的含量方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，為醫(yī)院制劑延續(xù)接骨丸中赤芍質(zhì)量的考察提供了參考方法，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法[12-17]。

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（收稿日期：2016-06-28）